zika病毒NS3蛋白功能以及E蛋白受体候选分子研究

发布时间：2020-05-19 16:59

【摘要】：zika病毒近几年在全球范围内爆发,给人类健康造成巨大威胁。研究发现,孕妇感染zika病毒与小头症婴儿的产生密切相关。因此,防控zika病毒传播成为亟待解决的问题。该病毒编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白,其中非结构蛋白NS3与NS5相互配合,共同实现病毒基因组RNA在宿主细胞内的复制。本课题旨在研究zikaNS3蛋白的功能和作用机制,探究其是否具有依赖于ATP水解活性的dsDNA解链活性,并找到影响酶活性的关键位点,以期进一步阐明病毒复制机制,为抑制病毒感染提供新的思路。首先构建zika病毒NS3原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达NS3蛋白,然后利用Ni柱对蛋白亲和纯化。利用ATPase试剂盒检测NS3蛋白的ATP水解活性,通过检测ATP水解速率,从而研究NS3的ATP水解活性。为研究NS3蛋白的dsDNA解链活性,在体外利用荧光共振能量转移(FRET)原理,建立双链核酸解旋系统,以荧光值的增加判断解链的发生,以此研究NS3解链活性大小。利用定点突变的方法,以野生型NS3载体为模板,得到NS3G198A突变克隆。在原核细胞中诱导表达突变体蛋白,并进行亲和纯化,得到NS3 G198A蛋白。通过Western Blot对蛋白定量后,比较G198A突变体与野生型NS3的ATP水解活性和dsDNA解链活性。通过原核表达和亲和纯化,可以得到较纯的zikaNS3蛋白。该蛋白在体外可以水解ATP,水解最大反应速率为2.76μmol/(L·min),其Km值为0.11 mmol/L;并且,zikaNS3蛋白在体外可以使dsDNA解链;NS3 G198A突变体蛋白水解ATP的速率和解链dsDNA的速率,较野生型均明显减弱。zikaNS3蛋白在体外具有依赖于ATP水解活性的dsDNA解链活性,198位甘氨酸是影响酶活的关键位点。Zika病毒为黄病毒属,单股正链RNA病毒。近几年zika病毒在全球爆发,严重影响了人类健康,成为亟待解决的问题。Zika病毒在感染细胞时,首先通过病毒表面的E蛋白识别宿主细胞表面受体,而与细胞结合。然后再通过细胞的内吞作用进入细胞,之后病毒将基因组释放到胞浆中,完成后续感染。因此,鉴定zika病毒受体,有助于阐明病毒入侵细胞的分子机制,也为抑制zika病毒感染提供有效的药物设计靶点。本研究旨在利用新近发展的蛋白质生物素化方法,结合质谱鉴定技术,寻找细胞表面与zika病毒E蛋白结合的分子。然后将得到的分子进行筛选,得到与E蛋白可能相互作用的候选分子,为找到zika病毒受体奠定基础。首先通过碱性磷酸酶(AP)显色系统,确定zikaE蛋白可以直接与细胞表面结合。具体是在真核细胞293T中表达E蛋白胞外段与AP的融合蛋白(ECD-AP)以及AP蛋白本身,收集上清并进行纯化后得到两种蛋白。将两种蛋白加入到zika病毒可以感染的SNB-19和GC1细胞中,结合后加入AP的底物进行显色反应,通过颜色的变化判断蛋白是否与细胞结合。然后通过辣根过氧化物酶(HRP)系统,将结合在细胞表面的E蛋白附近的蛋白生物素化。具体是在293T细胞中表达E蛋白胞外段与HRP的融合蛋白(ECD-HRP)以及HRP蛋白本身,在上清中纯化后得到两种蛋白。将蛋白结合到SNB-19和GC1细胞表面后,加入HRP的底物进行生物素化反应,则E蛋白附近的蛋白被生物素化。将生物素化反应后的细胞进行免疫荧光,用streptavidin_488抗体检测生物素化的蛋白。将生物素化反应后的细胞裂解,收集蛋白,并用亲和素珠子纯化。将得到的生物素化的蛋白进行质谱鉴定,分析对比实验组和对照组所鉴定到的蛋白,并结合文献查阅,初步筛选出可能的E蛋白的候选受体分子。AP实验发现,SNB-19和GC1细胞的ECD-AP实验组相比AP对照组,均呈现明显的蓝黑色产物;HRP实验显示,相比对照组,SNB-19和GC1细胞的ECD-HRP实验组的细胞膜呈现较弱的荧光;无论是SNB-19还是GC1细胞,质谱鉴定到的生物素化的蛋白种类均较少,但两种细胞的实验组均存在特异的差异蛋白,这些分子可能与E蛋白结合有关。zika病毒E蛋白的胞外段可以结合在SNB-19和GC1细胞表面;通过HRP系统结合质谱技术,可以鉴定到细胞表面与E蛋白结合的分子;质谱检测结果为寻找zika病毒受体奠定基础。
【图文】：

图１．１从ｐＣＤＮＡ６－ｚｉｋａ邋ＮＳ３质粒载体中扩增ＩＶＳ３１：邋ＮＳ３邋扩增片段逦２：邋ｍａｒｋｅｒ逡逑８ａ－ｚｉｋａ邋ＮＳ３表达载体测序结果逡逑子克隆得到的ｐＥＴ２８ａ－ｚｉｋａＮＳ３载体送至公司测序。用引物进行正向测序，使用Ｔ７邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ通用引物ｃｈｒｏｍａｓ图结果，确定此次测序结果较好。然后，用ＮＳ３理论序列进行比对，结果发现构建的载体ＮＳ３序部测通。逡逑２１０逦２２０逦２３０逦２４０逦２５０逦２６０逦２７０逦２８０逦２９０逦３００逦３１０逦３２０ｎＱ３ｉ＇ＴＧＩＱＸｒＱ＾ＴＣ邋迎孤－NBＧｔＱ０

图２．１考马斯亮蓝检测ｚｉｋａ病毒ＮＳ３蛋白在大肠杆菌中的诱导表达逡逑为了进一步检测ｚｉｋａＮＳ３蛋白在大肠杆菌中的表达，将上述诱导前后的蛋白进逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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本文编号：2671202