抗CD147全人源IgG1抗体的研制及生物特性的鉴定

发布时间：2020-05-19 15:03

【摘要】：背景:CD147(cluster of differentiation 147)是一个跨膜糖蛋白,高表达于多种肿瘤细胞,多项研究证实其参与多种疾病的发生发展,我们实验室前期研究也发现敲低CD147的表达可显著增强曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌敏感细胞的抑制作用,提示CD147是一个有价值的治疗肿瘤及自身免疫性疾病的靶点。目前,已有针对CD147的鼠单抗用于肝癌的靶向治疗。人源抗体在体内治疗应用中比鼠单抗更具优越性,尚未见相关报道。目的:运用实验室构建的噬菌体抗体库筛选平台筛选特异性人源抗CD147单链抗体(scFv),利用同源重组技术将scFv转换为人源抗CD147IgG1抗体,并鉴定其生物特性,为后续评价其生物功能奠定基础。方法:通过酸洗脱法从噬菌体抗体库筛选抗CD147-scFv,用常规ELISA、DNA测序、细胞ELISA和竞争抑制实验鉴定其特异性;用硫氰酸按洗脱法对其相对亲和力进行初步测定:以scFv为模板扩增scFv轻重链可变区,通过同源重组技术构建全人源抗CD147 IgG1真核表达载体并在293F真核细胞获得表达;用亲和层析法分离纯化抗体,SDS-PAGE鉴定纯化效果;用ELISA和Western Blot验证抗体的特异性;用CCK-8法初步测定抗体对表达CD147乳腺癌细胞增殖能力的影响。结果:1、通过四轮富集性筛选,抗体获得750倍富集;经常规ELISA、DNA序列分析、细胞ELISA和竞争抑制实验鉴定,获得了 3个具有不同基因型序列的特异性克隆(13号、15号和168号),其轻重链的可变区分属VλI/VH Ⅰ、VκⅢ/VHⅢ、和VλⅢ/VHⅢ亚群;成功进行可溶性表达后证实三者均可与CD147特异结合。用硫氰酸铵洗脱法测出3个抗CD147-scFvs的相对亲和指数(RAI)分别为0.2 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L,其中,168号的相对亲和力优于13号和15号。2、PCR扩增3种抗CD147-scFv的VH、Vκ/λ序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确;采用同源重组技术构建表达载体,琼脂糖凝胶电泳鉴定和DNA测序分析核实,显示成功构建了它们的完整人源IgG1表达载体。3、轻重链表达载体等比例转染HEK293F细胞,无血清培养液培养3天后收集部分上清进行ELISA检测,证实表达了完整人源抗体;继续培养至第7天,收集细胞上清,采用亲和层析法进行抗体分离纯化,SDS-PAGE鉴定纯化后抗体纯度可达95%;经过ELISA和Western Blot两种方法鉴定特异性,结果显示抗体能与CD147特异结合。4、采用CCK-8法测定结合活性较好的168号抗体对乳腺癌细胞增殖的影响,结果显示其对乳腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。结论:从噬菌体抗体库筛选出了抗CD147的特异性人源scFv,证实其特异性后在真核细胞成功表达出人源抗CD147 IgG1,并证实其对乳腺癌细胞的增殖有一定抑制作用。
【图文】：

对抗体的特异结合活性产生影响，需要将单链抗体变成可溶性抗体。将３种不同逡逑基因型的特异性噬菌体抗体感染大肠杆菌ＨＢ２１５１，以ＩＰＴＧ诱导进行可溶性表逡逑达并以ＥＬＩＳＡ检测可溶性抗体的特异性表达情况，ＥＬＩＳＡ实验结果如图１－４显逡逑示：３株阳性噬菌体抗体克隆可溶性表达后均能与ＣＤ１４７包被抗原特异结合，逡逑与无关０Ａ抗原和ＰＥＰ抗原不结合。逡逑１６逡逑

逑２．逦８噬菌体单链抗体的相对亲和力测定逡逑ＮＨ４ＳＣＮ洗脱法实验结果如图１－６所示，１３号、１５号、１６８号ｓｃＦｖｓ的亲和逡逑力指数分别约为０．２０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。在３种噬菌体单链抗体中，，逡逑１３号亲和力相对较低、１６８号亲和力最高。逡逑１２０0／0邋＿逦—Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７邋－１３逡逑＾逦°逦Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１５逡逑＾逦Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１６８逡逑ｆ邋１００％－逦？—逡逑ｔ＾－邋ＶＶ＼逦Ｔ逡逑Ｉ逦＼逦＼逦逦逦—逦漏逡逑Ｉ逦＼＼逡逑ｇ邋４０％邋－逦＼逦Ｔ逡逑｜邋逦１＾逡逑ｆ邋２０％邋－逦＼－N逦＊逡逑１逦＊逦－士逦＊邋一逡逑＜逦ｉ逦１逡逑０％邋－＊逦｜逦｜逦ｉ逦Ｉ逦ｌ逦Ｉ逦Ｉ逡逑０逦０．２逦０．４逦１逦１．５逦２逦３逡逑ＮＨ４ＳＣＮ（ｍｏｌ＊邋Ｕ）逡逑图１－６硫氰酸铵洗脱法检测相对亲和力逡逑Ｆｉｇ邋１－６邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｖｉｄｉｔｙ邋ｉｎｄｅｘ邋ｂｙ邋ａｍｍｏｎｉｕｍ邋ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ邋ｅｌｕｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑注：１３、１５和１６８：邋１３号、１５号和１６８号抗ＣＤ１４７单链抗体逡逑Ｎｏｔｅ：邋３，邋１５邋ａｎｄ邋１６８：邋ａｎｔｉ－ＣＤ邋１４７邋ｓｃＦｖ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑３．逦讨论逡逑ＣＤ１４７分子参与炎症、肿瘤、发育及其他疾病的病理发展进程，在细胞增殖逡逑与凋亡、肿瘤细胞转移与分化和肿瘤细胞耐药中起重要作用［９＿１４］。但是目前尚未逡逑见到关于人源抗ＣＤ１４７抗体在肿瘤方面的相关研究。逡逑噬菌体抗体库技术是一种可以不经免疫动物快速制备出人源抗体的技术
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2671068