载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A（APOBEC3A）对HIV-1启动子甲基化的调节

发布时间：2020-05-20 23:45

【摘要】：目的:HIV-1感染机体导致的潜伏感染是艾滋病(AIDS)无法治愈的主要原因之一,如何有效激活HIV-1潜伏病毒进而清除,是治愈AIDS的关键措施。其中HIV-1病毒潜伏库形成和维持的主要因素与HIV-1 5'LTR中CpG甲基化相关。APOBEC3A(A3A)是载脂蛋白B m RNA编辑酶催化亚基3(APOBEC3)家族成员之一,目前已经证实A3A能够识别甲基化胞嘧啶(methylcytosine,mC),参与DNA甲基化修饰的调节。A3A可以有效地激活HIV-1潜伏病毒,推测与A3A具有甲基化胞嘧啶脱氨酶活性有关,借助甲基化胞嘧啶脱氨酶活性催化5'LTR中的甲基化CpG去甲基化。为明确A3A对HIV-1启动子5'LTR上CpG岛甲基化的调节作用,通过构建并修饰携带有HIV-1启动子的甲基化载体,构建并筛选A3A异构体a(A3A Isotype a,A3A-a)和A3A异构体b(A3A Isotype b,A3A-b)高表达真核载体,分析A3A去甲基化功能,并探索其分子机制,为新型HIV病毒激活剂的研发奠定基础。方法:1.构建携带有HIV-1启动子5'LTR序列的载体p LTR-Luc2P-EGFP,CpG甲基化酶M.Sss I处理载体p LTR-Luc2P-EGFP,得到甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP,用亚硫酸氢盐修饰PCR测序和甲基化敏感的限制性内切酶酶切对甲基化载体进一步鉴定。2.HIV-1的5'LTR序列含有八个Cp G岛,易被甲基化,载体pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化位点位于载体启动子区域,并携带Luc2P和EGFP两个指示标志,因此分别用三种方法检测甲基化水平:(1)蛋白印迹(Western Blotting,WB)方法检测EGFP的表达,(2)荧光素酶方法检测相对荧光素酶活性和相对荧光素酶比值,(3)Real-Time PCR方法进行Hpa II敏感性分析。分别转染甲基化质粒pmeLTR-Luc2P-EGFP和未甲基化质粒pLTR-Luc2P-EGFP,验证初步选取的三种甲基化检测方法可行;转染不同甲基化程度(100%、75%、50%、25%、0%)的质粒,验证三种甲基化检测方法能检测不同的甲基化梯度,结果进行Pearson相关性分析,将0%、25%、50%、75%、100%设定为相应甲基化程度(100%、75%、50%、25%、0%)的标准值,对三种方法的测得值和标准值之间的相关性进行评价。3.从THP-1细胞mRNA中扩增得到A3A-a和A3A-b的cDNA,分别克隆至真核表达载体pASIB-HA和pCAGGS-HA。转染HEK-293T细胞,蛋白印迹检测A3A-a和A3A-b的蛋白表达,并筛选出A3A-a和A3A-b的高表达载体。4.将A3A-a、A3A-b高表达载体和阴性对照载体pASIB-HA-A3G与甲基化载体pmeLTR-Luc2P-EGFP分别共转染HEK-293T,在细胞水平中,WB方法检测指示蛋白EGFP表达和荧光素酶方法检测相对荧光素酶活性,评价A3A-a和A3A-b的去甲基化调节作用。5.将A3A-a高表达载体转染HEK-293T细胞,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测A3A和胸腺嘧啶糖苷酶(Thymine DNA glycosylase,TDG)的相互作用,研究A3A去甲基化分子机制。结果:1.经双酶切和测序鉴定携带有HIV-1启动子5'LTR序列的载体p LTR-Luc2P-EGFP成功构建;CpG甲基化酶M.Sss I处理,成功得到甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP;经亚硫酸氢盐修饰PCR测序和甲基化敏感的限制性内切酶酶切鉴定,证实甲基化处理有效。2.用WB、荧光素酶和Real-Time PCR方法检测甲基化水平。与未甲基化质粒p LTR-Luc2P-EGFP转染组相比发现,甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP转染组:(1)EGFP蛋白表达水平明显减弱;(2)相对荧光素酶活性明显减弱;(3)Hpa II的敏感性明显减弱。这些结果证实,甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化处理有效,并验证了上述三种方法可以用于甲基化检测。通过转染不同甲基化程度的质粒,随着甲基化程度的减弱:(1)EGFP蛋白表达水平逐渐增高;(2)相对荧光素酶活性和相对荧光素酶比值逐渐增强;(3)Hpa II的敏感性逐渐增高;Pearson相关性分析,结果显示上述三种方法的测得值和标准值之间均呈较强正相关,Real-Time PCR方法相关性最好,WB方法次之,荧光素酶方法相对较低;这些结果验证了三种方法可以用于检测不同程度的甲基化水平。3.PCR、酶切鉴定和测序结果均表明A3A真核表达载体pASIB-HA-A3A1-a/b、pCAGGS-HA-A3A2-a/b构建成功。经过WB筛选,pCAGGS-HA-A3A3-a和pCAGGS-HA-A3A3-b中A3A蛋白表达量较高,并用于后续实验。4.甲基化载体共转染结果显示,相较于对照A3G转染组,A3A-a和A3A-b组中EGFP的表达量明显上调,相对荧光素酶活性明显增强。5.Co-IP结果显示,在A3A和TDG蛋白位置处有明显条带,提示A3A与TDG蛋白存在相互作用。结论:1.在细胞水平上证实A3A分子异构体a和异构体b均可识别DNA中5-甲基胞嘧啶,催化HIV-1启动子CpG岛去甲基化,为进一步研究A3A对HIV潜伏感染调控奠定基础。2.A3A与TDG存在相互作用,提示A3A可能通过TDG依赖的活性DNA去甲基化途径参与5-甲基胞嘧啶去甲基化。
【图文】：

PCR扩增产物LTRFigure1-1PCRamplificationproductsofLTRM：DNAmarkerDL2000；1，，2：PCR产物LTR

14图 1-2 pLTR-EGFP 真核表达质粒酶切凝胶电泳结果Figure 1-2 Restriction digestion of eukaryotic expression vector pLTR-EGFPM：DNAmarker DL2000；1：Ase I 和 Nhe I 双酶切质粒 pLTR-EGFPM：DNAmarker DL15000；1，2：Ase I、Nhe I、Bgl II 酶切质粒 pLTR-EGFP
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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本文编号：2673391