骨髓间充质干细胞的分离培养及扩增对其归甾能力影响的机制初探

发布时间：2020-05-22 01:30

【摘要】：目的：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有多向分化潜能的细胞,可在体外长时间保持未分化状态,增殖能力强,易于在体外大量培养,可以特异迁移到损伤部位及肿瘤局部,向骨组织,心肌,软骨组织,肌肉组织等分化,对心肌梗死,脑梗死,急慢性肝功能衰竭等具有一定的治疗作用,显示了其强大的应用前景。然而,尽管骨髓中MSCs含量相对较多,但仍难以满足细胞治疗的需要,故常需要在体外进行培养扩增才能满足要求。已有研究显示,MSCs移植后在体内的归巢能力,会随着供体细胞在体外的培养传代而下降。归巢能力的下降又会进一步影响到MSCs在靶向组织中的植入,从而严重影响了MSCs对靶组织的修复作用。因此,提高MSCs向靶向组织的特异性归巢,是提高干细胞移植疗效的关键。MSCs表面可检测到CXCR4,CXCR6, CXCL12(SDF-1),CD44等细胞因子的表达,其中CXCR4/SDF-1轴的作用已被证实在MSCs的归巢中起到重要作用。本实验旨在通过体外分离培养健康人骨髓来源的间充质干细胞,观察不同代次细胞的生长特点；分析不同代次细胞CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44表达的差异,初步探究体外扩增传代对MSCs归巢能力影响的机制。方法：应用Ficoll密度梯度离心法将MSCs目骨髓中分离出来,利用其贴壁生长的特性加以纯化,在常规培养条件下培养至第7代,观察原代及第3、5、7代细胞的形态学特点。采用MTT法检测第3、5、7代MSCs的生长增殖特性,并绘制生长曲线。Real-time PCR法检测第3、5、7代MSCs中CXCR4,CXCR6, CXCL12,CD44的表达,记录每个样品的目的基因和内参β-actin的Ct值,计算相应的△Ct(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因),以及△△Ct(△△Ct=△Cta一△Ctb),最后计算2-△△Ct得到各代细胞目的基因的相对表达率,即不同代次MSCs中各细胞因子表达的差异倍数。所得数据用GraphPad Prism5软件进行分析。采用配对t检验进行统计学分析,p0.05被认为具有统计学意义。结果：MSCs原代细胞呈长梭形,细胞形态均一,扩增速度快,克隆形成能力强,体外培养1至2周可传代。传代后细胞生长速度明显加快,24小时内完全贴壁、伸展,重新变为长梭形,生长潜伏期较短(1-2天),培养4-7天即达到完全融合。骨髓间充质干细胞在体外的增殖能力较强,但随着传代扩增次数增加,其形态从细长梭形逐渐缩短变宽,增殖速率及总体扩增倍数亦随传代呈下降趋势。MSCs表达CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44,但其表达量随传代而下降。对于CXCR4而言,第5代MSCs的表达为第3代的53.18%,而第7代的表达仅为第3代的27.04%,且第3、5、7代MSCs中CXCR4的表达差异具有统计学意义(p0.05)。对于CXCL12而言,第5代MSCs的表达为第3代的56.59%,而第7代的表达量仅为第3代的27.41%,且第3、5、7代MSCs中CXCL12的表达差异具有统计学意义(p0.05)。对于CXCR6,第5代MSCs中的表达为第3代的76.37%,第7代的表达为第3代的42.12%,其中第3代与第7代,第5代与第7代MSCs中CXCR6的表达差异具有统计学意义(p0.05)。第5代相比第3代MSCs中CXCR6的表达具有下降趋势,增大样本量可能获得统计学意义。对于CD44,第5代MSCs中的表达为第3代的53.99%,第7代的表达仅为为第3代的23.56%。其中第3代与第5代,第3代与第7代MSCs中CD44的表达差异具有统计学意义(p0.05)。第7代相比第5代MSCs中CD44的表达下降趋势明显,增大样本量可能获得统计学意义。结论：体外培养可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,易于培养扩增,在体外的增殖能力较强,但增殖速率及总体扩增倍数随传代下降。其归巢相关因子的表达亦随传代培养而下降,提示间充质干细胞的归巢能力随扩增传代下降可能与CXCR4,CXCR6,CXCL12(SDF-1),CD44等归巢相关因子在MSCs中的表达水平下降相关。
【图文】：

密度梯度离心法,单个核细胞,常温,离心管

5rnlFicoll分离液上（下层为Ficoll细胞分离液，上层为骨髓标本，两者勿混合）。(5)常温下，，以2200r/min离心25分钟，离心管中形成密度梯度（图1)。(6)取界面层细胞，转入新的15ml离心管中，加入lOmlPBS，吹打混匀后，常温1500r/min离心5分钟，弃上清。(7)再次加入lOmlPBS,吹打混匀后，常温1500r/min离心5分钟，弃上清。(8)以DMEM-F12培养液（含10%胎牛血清，1%双抗）重悬细胞

细胞,细胞数,重复计数,计算计

(3)计数将计数板放在低倍镜下（10X10倍）观察计数。按图2计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过+5%。(4)计数的换算计数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为9
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】