HSV-1感染上皮组织后诱导的免疫反应特征及其对ILCs作用的研究

发布时间：2020-05-22 22:41

【摘要】：单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染是人类面临的重要健康问题。据世界卫生组织统计,目前67%的50岁以下人口感染HSV-1病毒。HSV-1感染会引起口唇疱疹、疱疹性脑炎等疾病,且新生儿和免疫缺陷病人感染后发病率和死亡率增加。目前已有几种抗HSV-1药物被批准用于临床治疗,如西多福韦,伐昔洛韦、喷昔洛韦和泛昔洛韦等。但这些药物均只能是消除症状、缓解疼痛,并不能清除潜伏的病毒或者防止疾病复发。同时,多个HSV-1疫苗的临床研究均未提供具有应用意义的结果。因此,为HSV-1疫苗及更高效治疗药物的开发提供更多的理论依据,我们需更深入的探究HSV-1感染机理。HSV-1通过感染人体上皮细胞进入机体,目前对于HSV-1在最初感染部位的免疫反应机理并不完全清楚。之前的的研究表明,在上皮及粘膜组织中存在一类天然淋巴细胞(Innate lymphoid cells,ILCs),其可被病原体感染的上皮细胞可产生一些天然免疫信号分子激活,并积极参与天然免疫反应及适应性免疫反应的形成。本文主要从探索HSV-1感染上皮组织后机体免疫系统反应特征及其对皮肤粘膜组织中的天然免疫细胞的激活机制出发,深入了解HSV-1与免疫系统相互作用。我们首先分析了 HSV-1对呼吸道上皮细胞的感染特征,发现当HSV-1感染人支气管上皮细胞16HBE后,细胞内与天然免疫反应相关的非经典途径的NF-kB通路被激活,表达具有募集及活化天然淋巴细胞(ILCs)的信号分子,如IL-33、IL-25。进一步利用小鼠模型的研究表明,相比于对照组与肌肉感染组,皮肤粘膜感染组小鼠在病毒感染后各个组织中尤其是神经组织中病毒载量更高,同时病毒感染导致上皮组织损伤,且上皮组织中与ILCs募集、激活相关的天然免疫信号分子的上调。HSV-1在破坏呼吸道粘膜上皮屏障之后进入粘膜下层与ILCs出现共定位。一系列结果表明HSV-1感染上皮组织会导致其出现组织损伤并诱导其产生募集及激活ILCs的细胞因子,随后病毒进一步感染分布于上皮组织中的ILCs。我们进一步利用HSV-1分别感染ILCs细胞和KMB17细胞,结果表明HSV-1能够在ILCs中增殖,但增殖率较上皮细胞KMB17中的低。同时,ILCs在HSV-1感染后出现了细胞基因表达的变化,如疱疹病毒侵入介质(Herpes virus entry mediator,HVEM)基因表达上升。我们进一步对ILCs对来源于同一供体的T细胞为中心的特异型应答反应的调控做了分析。ILCs具有非特异性刺激T细胞增殖的能力,HSV-1对ILCs的作用又可抑制ILCs本身所具有的刺激T细胞非特异性增殖的能力。这可能是HSV-1的gD蛋白与HVEM结合可以阻断HVEM与T淋巴细胞表面的LIGHT结合,从而抑制了 T淋巴细胞的活化与增殖。以上结果表明,HSV-1感染上皮组织后可诱导ILCs激活,随后ILCs被病毒感染并抑制T淋巴细胞发挥免疫应答。
【图文】：

」＞二邋４，逡逑图１：邋ＩＬＣｓ参与ＨＳＶ－１诱导Ｔ细胞免疫反应体外实验设计。逡逑本部分实验过程见上图１。逡逑我们利用分离的包括ＩＬＣｓ群体的细胞，首先观察ＨＳＶ－１在ＩＬＣｓ中的增殖情况。逡逑其过程为：从以往的ＨＳＶ－１感染并己出现病变的１６ＨＢＥ细胞中收获ＨＳＶ－１病毒经逡逑蚀斑滴定法测定病毒滴度为８．５＊１０２ＰＦＵ／ｍＬ，加入１００Ｗ到１＊１０５细胞／孔培养的逡逑ＩＬＣｓ邋（Ｌｉｎ－ＣＤ４５＋）细胞中，同时，设置同样病毒滴度感染的ＫＭＢ－１７细胞作为阳逡逑性对照，１２ｈ后，收集细胞悬液１００｜ｉｌ，提取病毒ＤＮＡ，测定病毒载量；逡逑随后我们对感染了病毒的ＩＬＣｓ邋（Ｌｉｎ＿ＣＤ４５＋）细胞悬液和ＫＭＢ１７细胞悬液所提逡逑取的ＲＮＡ中相关天然免疫信号分子ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬ、ＴＮＦ－ａ进行定量分析。具体逡逑过程为：病毒感染１２ｈ后，收取ＩＬＣｓ空白组、ＩＬＣｓ＋ＨＳＶ－１感染组、ＫＭＢ１７空白逡逑组、ＫＭＢ１７＋ＨＳＶ－１感染组细胞，提取ＲＮＡ，，Ｑ－ＰＣＲ检测各组细胞基因表达变化。逡逑为进一步了解ＨＳＶ－１对ＬｉｒｒＣＤ４５＋细胞即对ＩＬＣｓ的作用是否对其免疫学功能有逡逑所影响，我们使用ＩＦＮ－ｙ特异性的Ｔ细胞增殖实验，观察了邋ＩＬＣｓ在ＨＳＶ－１作用后逡逑对Ｔ细胞增殖反应的影响效果。实验流程如下：在ＩＦＮ－ｙ特异性的Ｅｌｉｓｐｏｔ板中

如基因邋ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ－ａ等均在病毒感染逡逑后表达水平上调（图１）；且１６ＨＢＥ细胞在病毒感染后，细胞内具有募集及活化天逡逑然淋巴细胞ＵＬＣｓ）的信号分子（如ＩＬ－３３、ＩＬ－２５）基因表达水平上调（图２）。逡逑这表明ＨＳＶ－１病毒感染上皮细胞后可能通过上调ＴＮＦＲ超家族成员基因表达水平，逡逑ＴＮＦＲ超家族成员基因表达水平上调可能会使ＮＦ－ｋＢ通路激活使上皮细胞产生具有逡逑募集及活化天然淋巴细胞（ＩＬＣｓ）的信号分子。逡逑１０００００－１逡逑…逦＊１＊＊逦画Ｏｈ逡逑Ｉ邋１０００°－邋ｉｉ＇－Ｊ逦Ｔ逦ｉｌ．ｊ邋．．．邋Ｃ３邋１２ｈ逡逑！逦１00°－逦ｍ逦．．．．逦ｉ逦ｉｉ逦ｉｉｉ逦ｙ逦－－逡逑Ｉ逦：：逦！ｌ邋Ｉ逦ｉｌｌ逦ｊ｜ｌ逦｜Ｍ逦｜Ｉ逦Ｍ！邋Ｉ逦！逦＾４８ｈ逡逑图１：邋１６ＨＢＥ细胞ＨＳＶ－１病毒感染后ＴＮＦＲ超家族成员基因表达水平分析。逡逑＊＊＊＊Ｐ＜0．０００１，邋＊＊叩＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１，叩＜０．０５（与未感染组邋１６ＨＢＥ邋细胞相比）。逡逑３８逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2676722