鼠伤寒沙门氏菌spvB基因对宿主细胞自噬的影响及其分子机制的研究

发布时间：2020-05-22 23:25

【摘要】：目的:鼠伤寒沙门菌spv基因是沙门菌感染中重要的致病因子。spv含有三个必需基因:正性转录调控基因spvR和两个结构基因spvB和spvC。本研究通过建立鼠伤寒沙门氏菌感染人肠黏膜上皮细胞的模型,观察下调spvB基因表达后,对于细胞自噬、自噬相关蛋白的影响,并探讨p38MAPK信号通路在鼠伤寒沙门菌spvB基因影响肠上皮细胞自噬中的作用,为沙门菌感染的临床治疗提供新的研究思路和靶点,为进一步研究耐药及非耐药沙门菌株中spvB对自噬影响的差异及其分子机制奠定基础。方法:一、鼠伤寒沙门菌spvB基因对于肠黏膜上皮细胞自噬的影响。分别使用携带spvB基因的鼠伤寒沙门氏菌野生株STM-211、敲除spvB基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株STM-ΔspvB和回补株STM-c-spvB与处于生长对数期的肠黏膜上皮细胞Henle-407细胞进行共培养,再使用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察细胞的超微结构;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色后镜下观察;稀释涂板作胞内细菌计数;免疫印迹法(Western Blot,WB)检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达,并比较各感染组和对照组之间的自噬强度是否相同。二、鼠伤寒沙门菌spvB基因在影响Henle-407细胞自噬中p38MAPK信号通路的作用。在原有的感染模型基础上增加p38MAPK通路抑制剂SB203580进行干预对照。于共培养后的1h和3h收集细胞,通过免疫印迹法检测p38的磷酸化水平和自噬标志蛋白LC3、p62的表达水平;免疫荧光染色观察自噬蛋白LC3的表达及分布。结果:一、鼠伤寒沙门菌spvB基因对于肠黏膜上皮细胞自噬的影响。1.使用透射电镜观察鼠伤寒沙门菌感染后Henle-407细胞的超微结构,在感染后的1h,正常对照组细胞未见到明显的自噬发生,而野生株感染组STM-211和STM-ΔspvB感染组镜下可见双层膜结构的自噬体和自噬溶酶体结构,以及大量的沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuoles,SCV)。2.MDC染色后荧光显微镜下观察,结果显示在感染后的1h,各组细胞内的绿色点状荧光均有不同程度地增多。在空白对照组细胞内仅有少许的荧光分布,荧光细胞的数量也明显少于受试菌感染组。STM-ΔspvB感染组的胞内荧光分布强度及荧光细胞数明显高于STM-211感染组。3.细胞内活菌稀释涂板计数在细菌干预后的1h,各感染组培养基中的细菌总量未明显差别,从2h开始,STM-ΔspvB感染组的细菌存活量明显低于STM-211和STM-c-spvB感染组,4h时,细菌数目虽有增长而STM-ΔspvB组较STM-211和STM-c-spvB组的数量差距依然很明显。4.WB检测野生株、突变株和回补株感染的细胞自噬水平与空白对照组相比,在感染后的1h,STM-ΔspvB组LC3Ⅱ的表达水平显著高于STM-211组和STM-c-spvB组,底物p62蛋白水平则较STM-211和STM-c-spvB感染组下降;感染后3h,LC3Ⅱ和p62蛋白水平表达保持感染1h时的趋势且程度更大。二、鼠伤寒沙门菌spvB基因在影响Henle-407细胞自噬中p38MAPK信号通路的作用。1.不同感染组p38MAPK通路的表达水平在不同组的沙门菌作用不同时间后,各个感染组的p38磷酸化水平均较对照组增高;感染后的1h,STM-ΔspvB组p38的磷酸化水平显著高于STM-211和STM-c-spvB感染组,这种趋势一直持续到2h和4h;并且STM-211、STM-ΔspvB或STM-c-spvB感染组随着时间增加,p38的磷酸化水平也呈升高趋势。2.WB检测抑制P38通路后各组细胞的自噬水平经SB203580处理后,对照组、STM-211和STM-c-spvB感染组的LC3Ⅱ水平较前无明显差异,而STM-ΔspvB感染组则显著降低;p62蛋白水平STM-ΔspvB感染组较SB203580处理前显著升高,其它组较处理前无明显差异。感染后3h,LC3Ⅱ和p62蛋白水平表达保持感染1h时的趋势,经SB203580干预后,STM-ΔspvB组LC3Ⅱ表达量显著升高,p62表达量显著降低,而STM-211和STM-c-spvB组LC3Ⅱ和p62蛋白水平较未经SB203580干预组无明显改变。3.免疫荧光检测在抑制P38通路后各组细胞的自噬水平共培养结束后2h,与对照组相比,各感染组细胞核周的LC3点状结构显著增加;STM-ΔspvB组显著多于STM-211组。经SB203580处理后,STM-ΔspvB组LC3颗粒荧光小点数量明显减少,STM-211组较处理前无明显改变。结论:1.spvB基因在沙门菌感染肠黏膜上皮细胞Henle-407抑制自噬的活性,以利于细菌自身的存活。2.p38通路在沙门菌感染时被活化,而spv B对p38通路的抑制作用是其抑制细胞自噬的关键机制之一。
【图文】：

图 1 电镜观察不同组的自噬结构ig.1 autophagosomes and autolysosomes in Henle-407 cell after infected with S.typhimurby TEM.注：黑色箭头所指为沙门菌囊泡，白色箭头所指为自噬体。 MDC 染色后观察不同组的自噬强度MDC 是一种细胞自噬活性检验的示踪剂，主要能够对细胞的自噬溶酶溶酶体进行选择性地荧光染色。在经过共培养后的 1h，各感染组的 Henle胞内的绿色点状荧光均有不同程度地增多。在空白对照组，细胞内仅有荧光分布，而其荧光强度明显弱于受试菌感染组，，提示为被荧光标记的或者基础水平的自噬，同时证明了沙门菌感染诱导了 Henle-407 细胞发生。STM-ΔspvB 感染组的胞内荧光分布强度明显高于 STM-211 感染组，胞的数量也多于 STM-211 感染组(P<0.05)。见图 2B&C。

图 2 各组细胞 MDC 染色（×40）.空白对照组；B.STM-211 感染组；C.STM-ΔspvB 感染组；D.各组荧光细胞数量的统计情况 *P<0.05，**P<0.01g.2 MDC staining of each group of cells（×40）A. Control group; B.STM-211 infection grouC.STM-ΔspvB infection group; D.statistics of fluorescent cells in each group .*P<0.05,**P<0.01.3 细胞内活菌数量的检测经过共培养 1h、2h 和 4h 后，收集不同组细胞并进行胞内活菌数的测定。检测，在细菌干预后的 1h，各感染组培养基中的细菌总量未明显差别，从 2始，STM-ΔspvB 感染组的细菌存活量明显低于 STM-211 和 STM-c-spvB 感染（P<0.05），4h 时，细菌数目虽有增长但是 STM-ΔspvB 组较 STM-211 和TM-c-spvB 组的数量差距依然很明显（P<0.05）。见图 3。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378

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