人乳头瘤病毒次要结构蛋白L2与主要结构蛋白L1相互作用位点的鉴定和功能研究

发布时间：2020-05-25 21:11

【摘要】：持续感染高危型人乳头瘤病毒是诱发女性宫颈癌的主要原因。人乳头瘤病毒是一类无包膜DNA病毒,其病毒衣壳由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2构成,其中,L2蛋白在病毒感染细胞的过程中发挥重要作用,包括病毒吸附、入胞、免疫逃逸、携带病毒基因组入核和病毒颗粒组装等过程。但目前L2蛋白三维结构至今尚未解析出,衣壳蛋白L1与L2的相互作用也未研究清楚,尤其是L2蛋白中与L1蛋白相互作用关键位点完全未知。因此,阐述HPV次要结构蛋白L2与主要结构蛋白L1的相互作用关键位点及其功能对HPV病毒学研究具有重要意义。为了探讨HPV次要结构蛋白L2与主要结构蛋白L1的相互作用关键位点及其功能,本论文进一步深入分析研究本课题组前期鉴定的L1五聚体内腔中四个影响病毒感染且可能与L2蛋白相互作用的关键残基(F256,R315,Q317和T340)的功能。首先,大规模制备L1-F256A、L1-R315A、L1-Q317A和L1-T340A突变假病毒,超速离心纯化获得较高纯度的突变病毒颗粒,利用ELISA和Western blotting分析突变病毒颗粒中次要结构蛋白L2构象变化和含量变化,检测结果发现除L1-F256A外,其余突变病毒颗粒中L2蛋白的含量较野生型显著降低,而在293FT细胞中发现四个突变假病毒的L2表达水平与野生型相当,即L1位点突变不影响L2表达,从而证明R315,Q317和T340这三个关键位点的突变导致病毒颗粒组装后L2蛋白含量减少;同时利用HPV16 L2抗体14H6检测发现F256突变后导致病毒颗粒中L2的14H6表位构象发生改变;进一步利用免疫荧光实验分析突变假病毒吸附和入胞能力的变化,检测结果显示4个位点突变后不影响假病毒吸附细胞外基质和细胞膜,但阻碍了假病毒内吞入胞。上述研究表明L1-F256、R315、Q317和T340对病毒感染极其重要,并且参与病毒主要结构蛋白和次要结构蛋白的相互作用。由于尚无次要结构蛋白L2的结构信息,我们首先分析L2蛋白的一级结构信息,利用软件分析其带电荷情况和预测蛋白质折叠后残基暴露情况,再基于L1四个关键氨基酸的性质,从L2中选取带负电荷和亲水的且暴露在表面的氨基酸进行突变分析,利用上述分析L1突变假病毒性质与功能的方法研究L2突变假病毒的性质与功能。病毒感染分析实验发现L2-D337A-D338A-D340A和L2-D329A突变假病毒感染能力显著下降;利用双抗夹心ELISA和蛋白免疫印记分析突变假病毒中L1与L2蛋白的含量及构象变化,检测发现L2-D337A-D338A-D340A三个氨基酸突变后导致病毒颗粒中L2蛋白完全消失,但在细胞中L2蛋白表达量同野生型相近;L2-D329A突变假病毒中L2蛋白有所变化但变化不明显,而L2蛋白的免疫反应性降低,说明329位点的突变导致颗粒组装过程中L2蛋白的构象发生改变;进而证明次要结构蛋白L2中D337、D338、D340和D329突变后导致组装入颗粒中的L2蛋白减少或者L2蛋白构象发生改变。同样,免疫荧光实验分析突变假病毒感染过程发现,突变假病毒颗粒中L2蛋白的消失使得L2-D337A-D338A-D340A假病毒丧失入胞能力,但不干扰它吸附细胞外基质与细胞膜,而L2-D329A突变假病毒则可正常入胞,而其感染能力显著下降,说明该位点可能与病毒入胞后的后续感染过程有关。基于上述研究获得的L1和L2蛋白相互作用的关键位点,尝试在病毒颗粒内部引入二硫键,锁定结构蛋白L1和L2的相互作用,为解析L2三维结构奠定基础。将L1和L2蛋白相互作用的关键氨基酸突变为半胱氨酸并相互配对制备假病毒颗粒,利用还原和非还原Western blotting分析发现L1-Q317C与L2-D329C配对的假病毒可形成大小约为180kD的蛋白条带,表明这两个氨基酸在病毒颗粒中成功交联形成二硫键,双抗夹心检测发现L2蛋白的免疫反应性有所下降,表明16L1-Q317C+L2-D329C假病毒中二硫键的引入引起L2蛋白的构象发生变化,可能导致L2N端第21-30位氨基酸的暴露发生改变,且感染率分析结果表明其感染能力显著下降;利用免疫荧光进一步分析16L1-Q317C+L2-D329C假病毒的初期感染过程的变化,发现突变假病毒均能正常吸附细胞外基质与细胞膜,并能正常入胞,表明二硫键的引入不影响假病毒吸附细胞。综上所述,本研究进一步研究了 L1蛋白中参与衣壳蛋白相互作用的四个关键氨基酸的性质和功能,首次鉴定了次要结构蛋白L2中与L1蛋白相互作用的关键位点,并分析了关键位点在病毒颗粒组装和感染中的作用,基于L1和L2相互作用关键位点成功地在病毒衣壳内部引入二硫键,为解析高分辨率的L2蛋白结构、阐明HPV组装和感染机制奠定基础,同时为HPV广谱疫苗或治疗药物的设计提供结构和功能信息。
【图文】：

基因组结构

ＨＰＶ是乳头瘤病毒科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）乳头瘤病毒属，无包膜的ＤＮＡ病逡逑毒，结构相对简单，由病毒衣壳蛋白和病毒基因组ＤＮＡ构成，其基因组长约７．２－逡逑８ｋｂ，结构如图１．１所示，按照功能的不同主要分为三个部分：早期区（ｅａｒｉｙｒｅｇｉｏｎ，逡逑ＥＲ），约占４ｋｂ，主要编码非结构蛋白即早期蛋白Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４－Ｅ７，与病毒的复逡逑制、转录与转化密切相关；晚期区（ｌａｔｅｒｅｇｉｏｎ，ＬＲ），大小约为３ｋｂ，编码主要逡逑结构蛋白Ｌ１和次要结构蛋白Ｌ２，只在增殖性感染的细胞中表达：非编码区即长逡逑调控区（ｌｏｎｇｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ，ＬＣＲ），位于早期区和晚期区之间，包含有重要的转逡逑录调控原件和ＤＮＡ复制的起始位点。编码区ＤＮＡ含有８到９个开放阅读框逡逑（ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ〉，编码早期蛋白和晚期蛋白，所有的ＯＲＦ均位于同逡逑１逡逑

生活周期

ｔｈｅ邋ｅａｒｌｙ邋ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ；邋ＰＡＬ：邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌａｔｅ邋ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ；邋ＰＥ：逡逑Ｅａｒｌｙ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ，邋ａｌｓｏ邋ｒｅｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ａｓ邋ｐ９７；邋ＰＬ：邋ｌａｔｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ．逡逑ＨＰＶ的生活周期如图１．２所示：病毒在进入宿主细胞后，在细胞内细胞因子逡逑的启动下启动早期蛋白Ｅｌ、Ｅ２的表达，促使病毒ＤＮＡ利用宿主细胞的复制系逡逑统进行基因组的复制。而早期蛋白Ｅ５、Ｅ６和Ｅ７则将激活成熟的、处于非复制逡逑周期的角质细胞，启动其分裂增生，促使病毒基因组持续复制和表达。为使携带逡逑有病毒ＤＮＡ的角质细胞迁移至上皮组织表层，被感染的上皮细胞不断地进行复逡逑制，因此ＨＰＶ早期蛋白Ｅ５、Ｅ６和Ｅ７的表达被上调，致使大量的Ｅ６、Ｅ７被表逡逑达，宿主细胞则因而脱离正常的细胞周期轨道。Ｅ４蛋白开始表达，并且启动晚逡逑期蛋白Ｌ１和Ｌ２的表达，，晚期蛋白在Ｅ４蛋白的协助下包裹病毒基因组形成新的逡逑病毒颗粒。而成熟的ＨＰＶ病毒从上皮细胞释放，细胞脱落，ＨＰＶ的生活史完成逡逑［７
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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