用超高分辨技术分析构成容积调控氯通道的LRRC8成员间以及LRRC8A与ANO1、IP3受体和小窝蛋白之间的相互作用

发布时间：2020-05-26 22:54

【摘要】：容积调控氯通道(volume regulated chloride channel,VRCC),也被称为体积敏感外向整流阴离子通道(volume-sensitive outwardly rectifying anion channel,VSOR),是氯离子通道大家族中的一员,因其能被细胞体积变化所激活,产生具有外向整流特点的氯离子电流而被命名为VRCC。VRCC表达分布广泛,存在于几乎所有脊椎动物细胞,自上世纪80年代被发现以来,众多实验证明VRCC在细胞容积的调节、细胞的增殖分化和凋亡、肿瘤耐药性的形成、脑缺血神经毒性损伤、胰岛素抵抗等生理、病理过程中发挥重要作用。2014年,两个小组独立同时报道了LRRC8(leucine-rich repeat-containing 8)家族蛋白是构成VRCC的分子基础,此外,Bestrophin及TMEM16A(Anoctamins-1)也被认为可能参与VRCC的构成。LRRC8家族蛋白作为构成VRCC的主要分子基础,其一共有5个成员:LRRC8A-E,这些成员的不同组合构成不同类型VRCC,其中LRRC8A可能构成VRCC的孔区。VRCC受细胞肿胀的激活机制尚不清楚。前期研究表明细胞内微域Ca~(2+)和细胞膜脂筏结构在VRCC的激活中占有重要地位,所以本课题将主要以此为切入点进行研究,致力于利用超高分辨率显微镜STORM技术在分子水平上分析激活VRCC的局部微环境的结构基础。随机光学重构显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)和结构照明显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)是近年来发明的众多超高分辨率显微镜技术中的两种。STORM利用一种光学可切换的荧光分子来实现高精度定位,它的分辨率在理论上可达到10-20 nm,10倍于传统光学显微镜的分辨率。SIM利用高频条纹照明所产生的莫尔纹,将样品的高频信号与低频信号分开,从而看清楚细胞的超细结构,它的分辨率理论上可以达到100 nm左右,并且由于SIM的时间分辨率非常高,可达到0.6秒/帧,所以可以进行活细胞水平的超高分辨率成像。Kv7/KCNQ钾离子通道家族含有5个成员,KCNQ1-5,其中KCNQ2和KCNQ3在生理状态下可以形成异源四聚体,而KCNQ2和KCNQ4则不能形成。最近利用STORM技术已经实现了区分KCNQ2-4之间不同超微结构的相互作用。利用这一新的发展,在第一部分研究中我们利用KCNQ分子间相互作用为模板,建立了利用STORM超高分辨技术分析分子间相互作用的超高分辨率实验平台以及数据分析方法。利用此实验平台,我们在第二部分主要用STORM技术分析了LRRC8家族蛋白质亚基的共定位以及LRRC8A与参与细胞膜微域结构和Ca~(2+)动力学的重要的蛋白质如ANO1、IP3R和小窝蛋白之间的相互作用。第一部分超高分辨率显微镜实验平台和数据分析方法的建立目的:建立稳定可靠的STORM和SIM实验平台以及数据分析方法。方法:(1)在HEK293A细胞中分别转染总量为300 ng的KCNQ2+KCNQ3以及KCNQ2+KCNQ4 cNDA。(2)进行SORM相关染色处理,并进行STORM成像。(3)利用OriginPro8和Metlab等软件进行数据分析处理。(4)分离培养大鼠DRG神经元,进行细胞免疫化学染色,标记Tubulin,然后进行SIM成像。(5)用携带荧光蛋白的病毒对野生型HEK293A的内质网和细胞膜进行特异性标记,然后结合细胞微灌流系统进行SIM活细胞成像,观察细胞膜和内质网的动态变化。结果:(1)在STORM成像下,KCNQ2和KCNQ3呈现明显共定位,但是KCNQ2和KCNQ4没有出现共定位。(2)可以清晰地观察到DRG神经元轴突的微管结构,与宽场成像相比分辨率明显提高。(3)可以清晰观察到特异标记的内质网和细胞膜的动态变化。结论:(1)我们建立了稳定可靠的STORM实验平台与实验方案,利用OriginPro8、Metlab、Adobe Illustrator CS6等软件建立了稳定可靠的数据处理方法。(2)我们建立了稳定的SIM实验平台和固定细胞以及活细胞成像实验方案。第二部分LRRC8成员间以及LRRC8A与ANO1、IP3R、caveolin-1间相互作用的研究目的:分析LRRC8家族蛋白各亚基之间的共定位情况,研究LRRC8A与ANO1、IP3R、caveolin-1间相互作用。方法:(1)建立敲除LRRC8A、LRRC8D、LRRC8E的HEK293细胞系(HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)),以及HEK293A~(LRRC8A-/-)、HEK293A ANO1-/-、HEK293ALRRC8A-/-,ANO1-/-细胞系。(2)在HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)细胞中分别转染总量为300ng的LRRC8A+LRRC8D或LRRC8A+LRRC8E,以未进行转染的上述细胞系作为对照,进行STORM染色、成像、数据分析。(3)在HEK293A~(LRRC8A-/-)细胞中转染带有RFP标签的LRRC8A质粒,同样地在HEK293A~(ANO1-/-)细胞中转染带有GFP标签的ANO1质粒,分别进行细胞免疫化学染色,共聚焦显微镜成像,检测两种抗体的特异性。然后在HEK293A~(LRRC8A-/-,ANO1-/-)细胞中转染总量为300 ng的LRRC8A和ANO1质粒,以未转染的上述细胞系作为对照,进行STORM染色、成像、数据分析。(4)利用STORM在野生型HEK293A细胞中研究三磷酸肌醇受体(IP3R)和LRRC8A以及IP3R和ANO1之间的相互作用。(5)利用STORM在野生型HEK293A细胞和HEK293A~(LRRC8A-/-)细胞中研究LRRC8A和小窝蛋白-1(caveolin-1)之间的相互作用。(6)利用STORM在野生型HEK293A细胞、HEK293A~(LRRC8A-/-)细胞以及HEK293A~(LRRC8A-/-)+LRRC8A细胞中研究β-环糊精对LRRC8A和caveolin-1之间相互作用的影响。结果:(1)在缺少内源性表达LRRC8A、LRRC8D和LRRC8E的HEK293A细胞(HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)),当将上述缺失LRRC8亚基转染表达后,利用STORM可以观察到LRRC8A与LRRC8D、LRRC8A与LRRC8E之间明显的相互作用。(2)来自RFP-LRRC8A和来自抗LRRC8A抗体的荧光信号具有良好的一致性,并且类似地,来自GFP-ANO1和来自抗ANO1抗体的荧光信号具有良好的一致性,证明LRRC8A与ANO1抗体特异性较好。(3)STORM实验中,LRRC8A和ANO1出现很好的共定位。(4)LRRC8A和ANO1均与IP3R呈现很强的共定位。(5)LRRC8A和caveolin-1出现很好的共定位。孵育β-环糊精后,caveolin-1表达降低,与LRRC8A共定位消失。结论:(1)LRRC8A与LRRC8D和LRRC8E相互作用,形成构成VRCC的异源多聚体。(2)ANO1与LRRC8A间存在相互作用。(3)LRRC8A与IP3R间存在相互作用,提示IP3R及细胞内微域Ca~(2+)可能参与VRCC的激活。(4)LRRC8A与caveolin-1相互作用,当脂筏破坏时,这种相互作用消失。但是对于caveolin-1是否参与VRCC的激活还需要进一步验证。
【图文】：

界面图,相关操作,界面

24图 1 STORM 相关操作界面Fig. 1 STORM related interfaceSTORM devices include lasers, controllers, microscopes, CCD cameramercury lamps, computer workstations (left panel in A). STORM usinterface (right panel in A) as shown in the figure adjustment options for lasintensity, exposure time, frame rate, TIRF angle. The original data of thSTORM is represented by the flash point taken by each frame of the imag

微灌,设备

图 2 SIM 相关设备及微灌流系统设备Fig. 2 SIM-related equipment and micro-perfusion system equipment(A) shows the SIM system related equipment, including lasers, microscopes,cameras, controllers, computer workstations and others. (B) shows themicro-perfusion system-related equipment, including perfusion controller,temperature gas controller, cell chip culture plates, multiple control panels.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R341

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