节食小鼠肠道中优势乳杆菌的分离鉴定及其在衰老相关炎症中的作用

发布时间：2020-05-27 01:36

【摘要】：肠道菌群对维持宿主的健康有重要作用,它不仅与一些疾病的发生发展密切相关,还影响宿主的衰老过程。在利用一些简单的模式生物如果蝇和线虫的研究中,科学家们发现一些细菌突变株决定了宿主的寿命,且某些细菌分泌的一些小分子物质与宿主的长寿相关。然而,在具有复杂的肠道共生菌群的哺乳动物中,发现能够促进或者延缓衰老及其相关疾病发生的肠道菌群成员并阐明其作用机制,仍然具有很大的挑战性。不造成营养不良的节食的抗炎与延长寿命的作用已在多种动物模型中得到证实,而在前期研究中发现,全生命周期的节食能够引起小鼠肠道菌群发生显著变化,尤其是增加小鼠肠道中有益菌Lactobacillus的含量,且节食塑造的肠道菌群与小鼠寿命及中年时期的代谢健康显著相关。因此,节食塑造的肠道菌群及其中的关键细菌类群在节食发挥抗炎与延长寿命作用中的功能值得进一步探究。首先,为了进一步解析肠道菌群对节食处理的响应情况,我们以雄性SPF级C57BL/6J小鼠为模型,设立节食组(减少30%进食量,CR)和自由进食组(NC),进行为期84天的实验,分析短期节食处理对小鼠代谢表型的影响,并利用高通量测序的方法监测节食处理过程中小鼠肠道菌群结构的动态变化。结果显示84天的节食处理能够显著改善小鼠的代谢表型,包括葡萄糖-胰岛素稳态增强、血清炎性相关因子瘦素水平降低、抗炎性脂肪因子脂联素的分泌增加。节食处理2周使小鼠肠道中建立起一种Lactobacillus占优势的肠道菌群结构,并显著降低小鼠血液中脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP;指征宿主循环系统中由肠道菌群产生的抗原总量)和系统性炎症因子TNF-α的水平。对50个响应节食处理的关键操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)进行共变化网络分析显示,节食小鼠肠道中丰度最高的Lactobacillus OTU与受CR抑制的大多数关键OTU呈显著负相关。节食处理在小鼠肠道中快速建立起Lactobacillus占优势的肠道菌群结构,并显著降低小鼠的系统性炎症水平,但优势Lactobacillus是否作为节食塑造的肠道菌群中的关键功能菌来发挥健康作用有待进一步验证。然后,我们采用“序列引导”的方法从节食处理约2周的小鼠粪便样品中分离出两株代表肠道中优势乳杆菌的菌株,并通过全基因组测序对这两株乳杆菌进行鉴定和比较分析。根据两株乳杆菌分离物与数据库中已有Lactobacillus murinus基因组间平均核苷酸相似性(average nucleotide identity,ANI)大于96%,将其鉴定为L.murinus,命名为L.murinus CR141和L.murinus CR147。全基因组比较分析结果显示,两株L.murinus全基因组序列组成高度相似,但长约1.6 Mb的片段在两基因组间互为倒位,且CR141和CR147分别含有40和46个菌株特异性蛋白编码序列(coding sequences,CDS)。作为节食小鼠肠道中占优势的细菌类群,这两株基因组序列高度相似的L.murinus菌株的功能需要进一步深入研究。我们利用多种研究模型分析了这两株在节食小鼠肠道中显著富集的L.murinus的功能。在TNF-α诱导的炎症Caco-2细胞模型中,添加10%的L.murinus CR147菌株的发酵液上清显著下调细胞炎性细胞因子IL-8的分泌水平。在秀丽隐杆线虫模型中,我们将L.murinus与线虫标准饮食Escherichia coli OP50混合饲喂线虫,发现以1:9比例混合E.coli OP50与L.murinus CR147显著延长线虫的寿命并增加线虫的产卵量。与L.murinus CR147菌株相比,L.murinus CR141菌株在细胞和线虫模型中均未显示类似的功能。之后我们将18月龄SPF级小鼠的粪便菌群移植到10月龄无菌小鼠中,发现添加L.murinus CR147能够显著改善衰老菌群造成的小鼠肠屏障破坏,从而减少小鼠血液中LBP含量并降低小鼠血液中TNF-α的水平。以上研究结果表明,L.murinus CR147可能作为节食塑造的肠道菌群中的关键有益细菌而对节食发挥抗炎与延长寿命的作用有重要贡献。综上所述,本研究发现从节食小鼠粪便样品中分离的优势L.murinus菌株是节食塑造的肠道菌群中对节食产生的健康效应有重要贡献的细菌。本研究对于人类抗衰老研究有重要贡献,提示我们通过选择性富集肠道中的关键有益菌能够作为改善肠屏障、减轻系统性炎症并延长寿命的新靶点。
【图文】：

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图 1-1 线虫成虫虫体解剖结构示意图（图片来源于 WormAtlas）（A）雌雄同体线虫。（B）雄性线虫。igure 1-1. The dissection of adult C. elegans (Figure is from WormAtlas). (A) Hermaphrodite.Male. Scale bar 0.1 mm.C. elegans 有雄性和雌雄同体两种性别，，均为含 5 对常染色体的二倍体，其中雌雄同体有两条 X 染色体（XX），而雄性线虫只有一条 X 染色体（XO）。雌雄同体线虫有 2 个卵巢个输卵管、2 个受精囊（Spermatheca）及单一子宫（Uterus）（图 1-1A）。雄性线虫有 1 个性腺（Gonad）、输精管（Vasdeferens）及 1 个高度特化为交配用的尾部（Tail），该特化部使得雄性线虫在显微镜下极易识别（图 1-1B）。雌雄同体线虫能够同时产生精子和卵母，可进行自体受精或与雄性线虫交配，但不能与其它雌雄同体线虫交配。雄性线虫只能精子，需与雌雄同体线虫交配才能繁殖。雌雄同体线虫自体受精可产生大约 300 个后代多数为雌雄同体线虫，仅约 0.1%的后代为雄性线虫。当雌雄同体线虫与雄性线虫交配者产生的精子竞争性地同雌雄同体线虫产生的卵母细胞结合，可产生 1000 多个卵，其中与雌雄同体后代各占一半。雌雄同体线虫自体受精使得纯合体母虫繁殖一群遗传背景完同的后代，而雌雄同体与雄性线虫交配有助于突变体的获得与保持、并实现突变性状在间的转移，C.elegans 这种特殊的生殖方式使得其成为遗传学研究的重要模式生物。本研使用的均为雌雄同体线虫。C. elegans 的基本生命周期[116]如图 1-2 所示。在适宜的培养条件下，雌雄同体线虫产生

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图 1-2. C. elegans 在 22 °C 时的生命周期（图片来源于 WormAtlas）。Figure 1-2. Life cycle of C. elegans at 22°C (Figure from WormAtlas).C. elegans 全基因组测序已于 1998 年完成，是第一个完成全基因组测序的多细胞真核生物，其基因组大小为 100 Mb（C. elegans Sequencing Consortium，1998）[120]，含有 20219 个蛋白编码基因（WormBase 版本 WS61）。研究显示，C.elegans 中至少 38%的蛋白编码基因在人类基因组中具有同源基因[121]，而人类基因组中 60-80%的蛋白编码基因在线虫基因组中存在同源基因[122]，已知的人类疾病相关基因中的 40%在线虫基因组中存在同源基因[123, 124]。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332;R33

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