HRSV纯化条件的探索及实验性疫苗免疫原性的初步评价

发布时间：2020-05-28 01:03

【摘要】：人类呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)是世界范围内引起各年龄组下呼吸道感染的重要病毒病原体之一,尤见于婴幼儿、老年人和免疫抑制个体,但临床上至今尚无安全有效的疫苗。本课题的研究目的是筛选出一种或几种HRSV的理想纯化方法,并对不同纯化产物进行免疫原性评价,为HRSV裂解纯化疫苗的研制积累一定的基础资料。研究内容主要包括：HRSV在人二倍体KMB17细胞上的大量繁殖、病毒收获液的超滤浓缩、HRSV不同方法的纯化和纯化条件的探索,以及纯化产物的免疫原性评价,并对灭活剂、佐剂和免疫程序等免疫原性的影响因素进行探索。使用细胞工厂和罗氏瓶两种容器培养HRSV,两者均可获得较高感染性滴度的病毒。细胞工厂培养HRSV的最佳条件还需进一步探索。将病毒收获液以100kD滤膜包超滤浓缩30倍和103倍后,分别使用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法进行纯化,并对纯化产物进行感染性滴度检测、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot鉴别。经还原电泳,2种纯化方法制备的纯化产物都在60～70kD间呈现一主要条带,Western blot证实为HRSV特异性F蛋白。结果表明Sepharose 4FF凝胶过滤层析法比蔗糖密度梯度离心法更适合于HRSV的纯化,效果更好、效率更高。但柱体积、上样量、洗脱流速等条件会对纯化效果产生影响。将蔗糖密度梯度离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析2种方法纯化HRSV所得样品免疫ICR小鼠,抗体阳转率相同,中和抗体几何平均效价(GMT)相近,虽然免疫剂量不同(前者的病毒蛋白含量是后者的2.5倍),但二者的免疫原性无统计学差异,说明Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化产物的免疫原性较高。在纯化样品的免疫原性影响因素的探索中,甲醛灭活组的抗体阳转率和中和抗体GMT都比β-丙内酯灭活组的高；铝佐剂对实验性疫苗的免疫原性影响不大；虽然Od、7d、14d和0d、28d两个免疫程序均能诱导相对较高的中和抗体水平(1：9.51～1：11.31),但结果提示多针免疫有助于提高抗体阳转率和中和抗体效价。
【图文】：

曲线,蔗糖密度梯度离心,蛋白含量,组分

图2.蔗糖密度梯度离心纯化组分的感染性滴度及蛋白含量Fig2.InfeetionstiterandProteineontentofPurifiedfraetionsofHRSVbysuerosdensitygradienteentrifugationSDS一PAGE还原电泳检测结果显示，17个组分中，仅7一n号5个组分都在60一7okD间可见一主要的蛋白带，，与HRSVF蛋白63kD分子量接近(见图3)，推测目的病毒可能就集中在这5个样品中。W亡Stemblot证实上述5个组分的60一7OkD间的条带具有HRSV特异性(见图4)。但病毒培养液中的牛皿清白蛋白66k分子量与F蛋白分子量相近，无法通过SDS一PAGE将二者分开。牛血清白蛋白残留量检测结果显示7号样的牛血清白蛋白含量为15.5林g/ml、约占总蛋白含量的0.05%)，所以60一70kD间的条带是HRSVF蛋白和少量牛血清白蛋白的混合物上述5个组分中，以7号和8号组分的目的病毒含量较高，这与图2所显示的病毒滴度有一个小峰相吻合。从蛋白含量曲线上可以看出，这5个组分的蛋白含量远低于2一6号组分，后者主要是一些杂蛋白。因为7号组分与8~11号组分的蛋白条有差异，在50一70kD间有3个条带故我们将7号组分作为一个单独样品，将电泳条带相似的8、9、10、11号组分合

电泳图,组分,蔗糖密度梯度离心,电泳图

分;3:9号组分;4:10号组分;5:11号组分;6:30倍浓缩HRSV(30倍稀释还原)。图3.蔗糖密度梯度离心纯化组分的电泳图Fig3.EleetroPhoretieProfileofPurifiedfraetionofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation8号组分;3:分;9号组分;4:10号组5:11号组分;图4.蔗糖密度梯度离心纯化组分的Westernb一ot分析Fig4.WesternblottingofPurinedfraetionsofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】