五指山小型猪近交系中猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型的筛选与鉴定

发布时间：2020-05-28 02:55

【摘要】：器官移植是中晚期器官衰竭患者重要的治疗方法,为解决临床供体短缺问题人们将目光投向了异种移植。猪在生理学特性、器官匹配度等方面与人类极为相似,且具有繁殖率高、遗传性状稳定等特点,是最适合异种移植的供体。所有猪源细胞均存在猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV),完整的病毒粒子可释放到胞外。它以前病毒、多拷贝方式整合在宿主基因组中,不能用常规的培育无特定病原体(Specefic pathogen free,SPF)猪、免疫抑制等方法去除。已证实PERV可在体外感染多种人源细胞,且与致瘤性的鼠白血病病毒(Murine leukemia virus,MLV)、猫白血病病毒(Feline leukemia virus,Fe LV)等C型反转录病毒有相似的整合方式,这些都引起人们对异种移植诱发人兽共患病的担忧。欧洲药品管理局(EMEA)和美国食品药物管理局(FDA)相继颁布的行业指南,对临床异种移植的伦理问题与病原安全性做出了明确的规定;国际异种移植协会(IXA)发布了无指定病原体(Designated pathogen free,DPF)猪的病原体名录,也详细描述了Ⅰ型糖尿病猪胰岛产品在进行临床试验时的条件~([1])。为了充分利用我国丰富的小型猪资源,实验室在前期工作中已对我国多种小型猪种的PERV拷贝数进行检测。结果表明,与贵州香猪、巴马小型猪等相比五指山小型猪具有PERV-A型、PERV-B型拷贝数低且无PERV-C型等优势,同时该近交系是连续20代以上的近亲交配,基因纯合度达到60%以上,易于构建医用模型。因此,我们有望通过在选育的低拷贝五指山小型猪近交系中筛选出PERV基因缺陷型小型猪,进而培养出为临床提供异种移植器官供体的新品系。本研究主要进行的工作内容包括对五指山小型猪近交系进行初步筛选,并经过确证实验得到无PERV传染性猪,做反转录酶活性检测,对其中1头猪做全基因组重测序。1、无PERV传染性五指山小型猪的初步筛选采集五指山小型猪的股动脉血,分离PBMC细胞与HEK293细胞共培养4天后去除PBMC,提取HEK293细胞的总RNA,运用RT-PCR方法,检测PERV结构基因gag、pol、env的表达情况,初步筛选出不释放嗜人性PERV的小型猪作为候选。结果显示105份HEK293细胞中有17份不存在PERV的表达,其对应的小型猪为候选无PERV传染性小型猪。2、无PERV传染性五指山小型猪的确证将与候选猪PBMC共培养的HEK293细胞继续培养30~60天,每周收集一次细胞基因组DNA及总RNA,PCR及RT-PCR检测HEK293细胞中是否有新出现的PERV结构基因,筛选出结果始终为阴性的样品。结果显示17份样品中12份始终无PERV存在与表达。在HEK293细胞培养过程中,每次传代前收集细胞上清,经处理后做反转录酶活性检测。测量的OD405值小于标准曲线纵轴截距的2倍即为无效值,说明无反转录酶活性。若始终检测不到反转录酶活性,说明无PERV病毒粒子释放到胞外,则验证该头猪确为无PERV传染性五指山小型猪。结果显示12份样品中有8份始终检测不到反转录酶活性,该8头猪确为无PERV传染性五指山小型猪。3、无PERV传染性猪全基因组序列测定对其中1头生长状况良好的无PERV传染性五指山小型猪(体号:452)进行全基因组重测序,提取其PBMC细胞的基因组DNA,利用IlluminaHiSeq 4000平台完成,选定的参考基因组为F_(20)五指山近交系猪(Gen Bank:AJKK01000000.1)。对测序数据进行质量控制,结果表明测序质量好。对测序结果、与参考基因组比对结果、变异信息注释结果进行统计。提取WZSP452中所有PERV-pol基因片段发现序列均不完整;分析WZSP452中唯一包含gag、pol、env结构基因的scaffold5028得出,三个基因均提前终止,未完全表达。4、带有N碱基的pol序列基因克隆与序列分析为获得scaffold640的pol中缺失N碱基的准确序列信息,设计并合成452号猪scaffold640 pol上下游引物,用PCR的方法扩增scaffold640 pol全长,与p MD-18T载体相连后在E.coli DH5α感受态细胞中转化,对菌落PCR鉴定及双酶切鉴定正确的阳性质粒测序。测序信息与全基因组序列结果进行比对从而获得N碱基的完整信息。我们通过对筛选出的无PERV传染性五指山小型猪中的一头进行全基因组重测序,鉴定出是PERV-pol基因缺陷型猪。这是国内外首次通过近交培育结合自然筛选方法获得,具有经济、安全等优点。本研究结果推动了五指山小型猪PERV缺陷型新品系的建立,有利于我国小型猪的开发和利用,为异种移植提供合适供体。
【图文】：

基因组结构

ERV 是 C 型 RNA 病毒，属哺乳动物反转录动物科（Retroviridae毒属（Mammalian retroviridae），以前病毒的形式整合在宿主基随染色体的复制而复制[38~40]。它最早是在 1971 年由 Armstrong内发现的一类内源性病毒粒子[41]。PERV 的基因结构是单股、正，单体长 7~9kb，两端是 5'、3'非编码区（noncoding region），、pol、env 三个编码基因，，5'端有甲基化帽结构，3'端有多聚 A 尾（ 1）。两端的长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）具有功能，可调控病毒转录、复制与整合[42]；gag 区可编码核心蛋白，如衣壳蛋白、基质蛋白等；pol 区可编码反转录酶（RT）、蛋和整合酶（IN），对于病毒反转录及整合入宿主基因组中尤为重可编码病毒的囊膜蛋白[43]。

特异性基因,猪种,阳性对照,细胞共培养

猪内源性反转录病毒 pol 基因筛选结果情况细胞共培养 4 天后 3 遍以去除 PBMC基因的方法来检测为阳性对照，以无示：阳性对照在 50及阴性对照均未见预M a b c d e f
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332

【参考文献】