BDV-P和BDV-N与宿主相互作用的差异蛋白质鉴定及生物信息学分析

发布时间：2020-06-01 11:44

【摘要】：背景:1885年,在德国Sachsen地区Borna镇流行一种造成大量军马死亡的疾病,命名为Borna病(Borna disease,BD)。经证明Borna病是由一种嗜神经病毒感染造成,这种病毒称为Borna病病毒(Borna disease virus,BDV)。BDV可以感染各种脊椎动物,也包括所有温血动物。BDV持续感染许多动物物种的中枢神经系统并导致行为障碍,如焦虑、攻击、多动、异常行为和认知缺陷。近20年在对精神患者(尤其是精神分裂症、抑郁症和双相情感障碍)的大量流行病学研究中发现,部分精神患者的脑脊液和血液中能检测到BDV的抗体和核酸,预测与人类精神疾病有关。BDV自然可导致严重的免疫介导的神经疾病如爆发性脑炎。但是,在实验室新生大鼠感染脑炎症状不明显,在不引起神经细胞破坏及中枢神经系统炎症的情况却导致宿主(大鼠)行为学异常和学习认知功能障碍。BDV如何感染以及如何致病仍然不清楚,特别是BDV在宿主的作用起始靶点。目前文献对BDV的磷蛋白质(P)、核蛋白质(N)、糖蛋白质(G)、非糖基化蛋白质(X)作用机制都有研究,其中P蛋白质和N蛋白质在发病机制中起主要作用,也是目前研究最多的,特别对P蛋白质的研究尤为关注。目的:本实验针对于BDV的P(P24)质粒和N(P40)质粒构建慢病毒载体,并利用慢病毒载体感染原代神经元,筛选出与BDV-P/N蛋白质结合的差异蛋白质,以期进一步找出与BDV-P/N蛋白质结合的关键宿主蛋白质,并探索其致病作用。方法:1.扩增pEGFP-N1-P24和p EGFP-N1-P40质粒(实验室保存)并测序,用于后续慢病毒包装。2.进行慢病毒包装及滴度测定,并感染原代海马神经元,Western-blot方法检测P24和P40是否表达。3.提取慢病毒感染胎鼠海马的蛋白质做免疫共沉淀实验,实验分为BDV-P(P24)组,BDV-N(P40)组,NC组;抗体分别用P24抗体,P40抗体,兔IgG抗体;免疫共沉淀复合物做LC-MS/MS质谱分析。4.质谱鉴定蛋白质复合物成分的结果,与对照组比对得出差异蛋白质,进行生物信息学分析对差异蛋白质进行预测。5.对上述预测差异蛋白质进行验证。结果:1.质粒扩增后测序序列正确并成功转染SH-SY5Y细胞,Western-Bolt验证P24和P40蛋白质正常表达。2.过表达慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,能成功感染原代细胞并表达BDV-P(P24)和BDV-N(P40)。3.免疫共沉淀复合物质谱分析结果后得到差异蛋白质,用venny分析筛选到453个与BDV-P相互作用的候选蛋白质,;筛选到259个与BDV-N相互作用的候选蛋白质。4.进行GO,KEGG和PPI网络注释以探索这些蛋白质之间的作用。根据生物信息学的分析,预测酰基辅酶A结合蛋白质(ACBP,又名安定受体抑制肽DBI)与BDV-P结合,RT-qPCR实验将ACBP(DBI)及涉及的GABA-α1、GABA-α2、GABA-α3进一步验证,ACBP(DBI)、GABA-α1、GABA-α2上调(P0.05),GABA-α3没有显著性差异(P0.05)。结论:1.本实验成功构建BDV-P(P24)和BDV-N(P40)的过表达慢病毒载体,并能成功感染细胞,为BDV的基础研究提供了更有力的技术方法。2.免疫共沉淀得到的差异蛋白质结果可做后续实验分析,我们筛选到了453个与BDV-P相互作用和259个与BDV-N相互作用的候选蛋白质,这些数据为深入研究BDV-P/N与宿主结合致病机制和作用方式提供了线索。以期能筛查出BDV与人类精神疾病发生联系的蛋白质,进一步探讨BDV的发病机制。3.在PPI分析中,提取部分相关蛋白质之间的连接用于进一步的相关分析。我们推测ACBP(DBI)与BDV-P结合,可能参与BDV感染宿主后致焦虑的过程。4.另外结合生物信息学的分析和文献的报道,我们推测,第一:BDV-P蛋白质参与组胺H1/H2受体介导的信号传导途径,可能是BDV感染后焦虑和记忆损伤的关键。第二,BDV-P蛋白质的Slit/Robo轴突导向分子与肿瘤的关系,感染BDV后可能会抑制胶质瘤侵袭。
【图文】：

图 1 质粒转染 OL 细胞的鉴定A. 质粒转染后荧光检测；B. 质粒转染后 P40 和 P24 蛋白表达验证。Figure 1 Detection of post transfection in SH-SY5Y cells.AFluorescence expression of GFP at 24h post-transfection in SH-SY5Y cells. B Expression oP40 and P24 proteins detected by WB.2.2 病毒滴度检测结果慢病毒 LV5-P24 和 LV5-P40 感染 293T 细胞滴度见图 2。结果可见构建的慢病毒能成功感染 293T 细胞，荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度最终测出病毒滴度为 1×109TU/mL。

图 2 荧光检测慢病毒滴度Figure 2 lentivirus titers were detected by fluorescence.病毒感染原代神经元结果组化的荧光染色结果表明（图 3-A）： 我们所培养的原代神经被以 MAP-2 抗体识别, 发出特异性的红荧光，可达 60%～80细胞核发出蓝光，表明所培养的细胞主要为神经元。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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本文编号：2691438