趋化因子CCL19对小鼠认知及情绪样行为的影响

发布时间：2020-06-02 15:58

【摘要】：情绪和认知是高级神经精神活动的重要内容,其功能研究是脑科学研究的重要部分。免疫系统参与调节中枢神经系统的思维活动,其机制错综复杂,其中亦包括免疫细胞以及免疫分子如细胞因子等对中枢神经系统功能的调节作用。并且,神经精神疾病与免疫系统炎症密切相关,可表现为临床上常见的中枢神经系统疾病与免疫系统的“共病”现象,包括慢性炎症与抑郁症“共病”,艾滋病与痴呆症“共病”的现象等。其中免疫系统的细胞因子以及趋化因子是导致该“共病”现象的重要活性分子,发挥对认知功能相关疾病如阿尔茨海默病,以及情绪障碍相关疾病如焦虑症、抑郁症等疾病的重要调节作用。联体结合模型(Parabiosis)通过血管吻合术将两只小鼠腹部缝合在一起,使两只小鼠共用一套血液循环系统。近年来,该模型被广泛应用于衰老领域的研究,是研究免疫分子对中枢神经系统功能影响的重要模型。2011年斯坦福大学Tony Wyss-Coray教授课题组为研究免疫微环境对机体衰老的影响,采用联体结合模型,筛选出6个系统因子(Systemic factor)在这一过程中发挥重要作用,包括CCL2(MCP-1)、CCL11(Eotaxin)、CCL12(MCP-5)、CCL19(MIP-3β)、β_2M(β_2 microglobulin)、触珠蛋白(Haptoglobin)。这六个系统因子中,CCL2及CCL12对中枢神经系统的功能的调节作用已有较多报道,CCL2水平升高与认知功能损伤程度呈正相关,CCL12与低氧诱导的神经炎症关系密切。该团队随后研究表明,CCL11、β_2M可抑制小鼠海马区的神经发生,导致小鼠学习记忆能力下降;侧脑室注射CCL11中和抗体可显著改善CCL11对小鼠海马区神经发生的抑制作用,恢复小鼠空间学习记忆能力,而敲除β_2M基因亦可改善上述损伤。趋化因子CCL19是在联体结合模型基础上筛选出的6个系统因子之一。它属于趋化因子CC家族,其受体为CCR7。在免疫系统中,CCL19主要由中性粒细胞、巨噬细胞等分泌,其受体主要表达在T淋巴细胞、B淋巴细胞、DC细胞表面。CCL19通过与CCR7受体结合趋化T淋巴细胞、B淋巴细胞、DC细胞迁移至病灶区域发挥作用。此外,CCL19/CCR7轴亦对T淋巴细胞的归巢及存活发挥重要作用。近年来研究表明,大脑的星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞皆可分泌趋化因子CCL19,在中枢神经系统炎症时,趋化免疫细胞进入中枢神经系统,到达病灶区域。中枢神经系统炎症反应亦伴随着血浆中CCL19表达水平的异常,例如多发性硬化症、脑缺血性损伤、神经炎症疾病的患者,其血液和脑脊液中趋化因子CCL19的表达水平皆异常升高。CCL19受体CCR7可表达于海马、胼胝体区域的星形胶质细胞,然而其对星形胶质细胞功能的影响尚不清楚。CCR7基因敲除的小鼠表现为学习记忆能力的损伤,以及抑郁及焦虑样情绪障碍。以上研究提示趋化因子CCL19/CCR7对中枢神经系统的作用不可忽视。情绪和认知是最为重要的两类脑高级神经精神功能,但是,目前报道趋化因子CCL19对情绪以及认知功能的影响尚不明确。本课题以正常小鼠以及长期不可预期性慢性应激模型小鼠为研究对象,研究趋化因子CCL19对小鼠认知样行为以及情绪样行为的影响。并从免疫系统功能和神经系统功能两个方面,研究趋化因子CCL19对认知或情绪样行为影响的机制。第一部分趋化因子CCL19对正常小鼠认知及情绪样行为的影响1.趋化因子CCL19对正常小鼠认知样行为的影响选取2-3月龄C57BL/6小鼠,分别侧脑室单次注射CCL19(0.05μg)以及隔天腹腔注射CCL19(10μg/kg),注射共12次历时35天。通过六臂水迷宫实验,观察CCL19对小鼠空间学习记忆能力的影响;通过新物体识别实验,观察CCL19对小鼠物体识别记忆能力的影响。结果表明,趋化因子CCL19单次侧脑室注射和腹腔注射12次,均对小鼠在六臂水迷宫实验中的错误数,新物体识别实验中物体辨识指数无显著影响,提示趋化因子CCL19对小鼠的认知样行为无显著影响。2.趋化因子CCL19对正常小鼠情绪样行为的影响采用上述给药方式,通过高架O型迷宫实验和糖水消耗实验,观察趋化因子CCL19对小鼠焦虑及抑郁样情绪的影响。结果表明,趋化因子CCL19显著增加了小鼠的糖水消耗率,减少了小鼠在高架O型迷宫中开放臂的停留时间。以上实验结果提示,趋化因子CCL19可能对小鼠的焦虑及抑郁样行为有明显影响。3.趋化因子CCL19、CCL21中和抗体对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响趋化因子CCL21是趋化因子CCL19的共受体因子,可以与CCR7结合发挥对免疫细胞的趋化作用。CCL21对焦虑及抑郁样行为的作用亦不明确。因此,本部分实验旨在进一步确认CCL19及CCL21对焦虑及抑郁样行为的影响,并采用CCL19及CCL21中和抗体研究CCL19及CCL21对情绪反应的作用。选用2-3月龄C57BL/6小鼠,分为五组,分别为正常组(腹腔注射PBS),CCL19组,CCL21组,CCL19中和抗体组,CCL21中和抗体组。隔天腹腔注射CCL19、CCL21(均为10μg/kg),注射共12次历时35天。第30天时,分别侧脑室注射CCL19、CCL21(均为0.05μg)中和抗体及同型对照抗体(正常组及CCL19、CCL21处理组注射同型对照抗体0.05μg)。第36天进行行为学实验。通过高架十字迷宫以及旷场实验评价小鼠的焦虑样行为,通过糖水消耗实验以及强迫游泳实验评价小鼠的抑郁样行为。结果表明,各处理组小鼠的自主活动性均无显著性差异。CCL19腹腔注射显著增加小鼠的糖水消耗率,降低小鼠在强迫游泳实验中的不动时间,对小鼠在高架十字迷宫中的开放臂停留时间以及旷场实验的中间区域运动时间无显著影响。提示CCL19对小鼠抑郁样行为有显著影响,对小鼠焦虑样行为无明显影响。CCL21腹腔注射显著增加小鼠糖水消耗率,对小鼠在强迫游泳实验中的不动时间、旷场实验的中间区域运动时间及高架十字迷宫的开放臂停留时间无显著影响。提示CCL21对小鼠焦虑及抑郁样行为均无明显影响。侧脑室注射趋化因子CCL19以及CCL21中和抗体后观察小鼠的抑郁和焦虑样行为,结果表明小鼠在上述各行为学实验中的表现与同型对照抗体注射组小鼠表现无显著差异,提示侧脑室注射CCL19、CCL21中和抗体对CCL19及CCL21的情绪相关作用无显著影响。第二部分趋化因子CCL19对长期不可预期性慢性应激小鼠抑郁及焦虑样行为的影响在确定CCL19对正常小鼠的抑郁样行为有显著影响的基础上,采用长期不可预期性慢性应激(CUMS)模型,评价趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠焦虑样及抑郁样行为的影响。实验分五组,分别为正常组(腹腔注射PBS),CUMS模型组(腹腔注射PBS),阳性药氟西汀给药组(10 mg/kg),CCL19组(10μg/kg),CCL19与氟西汀合用组(10μg/kg+10 mg/kg)。隔天腹腔注射CCL19,注射共12次历时35天。第25天至第35天,每天腹腔注射氟西汀,给药共10次。造模持续35天,于第36天进行行为学实验。1.趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠体重及自主活动的影响采用自主活动实验评价趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠的自主活动性的影响。结果表明,CUMS造模显著降低小鼠体重,氟西汀及趋化因子CCL19腹腔注射可以在造模后期(第22天至第24天)缓解小鼠体重的下降。各处理组小鼠的自主活动性均无显著性差异。2.趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠焦虑样行为的影响通过高架十字迷宫以及旷场实验评价小鼠的焦虑样行为。结果表明,CUMS模型鼠在高架十字迷宫开放臂停留时间显著减少,在旷场的中间区域时间显著减少,提示CUMS模型小鼠出现明显的焦虑样行为。氟西汀、CCL19以及两者合用对小鼠在高架十字迷宫开放臂停留时间及旷场中间区域时间均无显著影响,提示氟西汀及CCL19对小鼠的焦虑样行为无显著影响。3.趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠抑郁样行为的影响通过糖水消耗实验以及强迫游泳实验评价小鼠的抑郁样行为。结果表明,CUMS模型小鼠的糖水消耗率显著降低,强迫游泳不动时间显著增加,提示CUMS模型小鼠表现为抑郁样行为。氟西汀和CCL19显著增加CUMS模型小鼠糖水消耗率,降低其强迫游泳不动时间,提示氟西汀及CCL19对小鼠的抑郁样行为有显著改善作用。CCL19与氟西汀合用对小鼠的糖水消耗率、强迫游泳不动时间无进一步影响。第三部分趋化因子CCL19对小鼠抑郁样情绪影响的机制研究趋化因子CCL19能改善CUMS模型小鼠的抑郁样行为,在此基础上,从免疫系统及中枢神经系统两方面评价趋化因子CCL19对小鼠抑郁样情绪影响的机制。1.趋化因子CCL19对小鼠免疫系统功能的影响1.1趋化因子CCL19对正常小鼠免疫功能的影响趋化因子CCL19在免疫系统的主要功能是趋化免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、DC细胞的迁移,参与维持T淋巴细胞的寿命,对机体的免疫功能有重要作用。本研究首先通过[~3H]-TdR掺入法观察趋化因子CCL19对正常小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响。结果表明,趋化因子CCL19能够显著抑制ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖反应。接下来,采用流式细胞术检测CCL19对正常小鼠全血免疫细胞比例的影响。结果表明,趋化因子CCL19能够增加调节性T淋巴细胞百分比,降低CD4~+、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核细胞百分比。进而,采用Luminex实验研究趋化因子CCL19对正常小鼠海马和血浆中细胞因子表达的影响。共检测13个跟炎性反应密切相关的细胞因子,包括CCL19,CCL21,IL-β,TNF-α,IL-4,IL-10,IL-6,IL-17,IFN-γ,RANTES,CCL2,CX3CL1,CCL17等。结果表明,CCL19腹腔注射显著降低海马脑区RANTES、IL-1、IL-1β等表达水平,CCL19中和抗体能够逆转CCL19对这些细胞因子的降低作用。CCL19对正常小鼠血浆中各细胞因子表达无明显影响。CCL19腹腔注射对正常小鼠血浆中CCL19的水平有降低趋势,对小鼠海马中CCL19的水平有升高趋势。CCL19中和抗体能够逆转CCL19腹腔注射对小鼠血浆及海马CCL19水平的作用。1.2趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠免疫功能的影响采用Luminex实验研究趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠海马和血浆中细胞因子表达的影响。结果表明,与对照组相比,CUMS模型小鼠海马中CX3CL1、IL-10及IL-1β表达水平显著降低。氟西汀显著升高海马中CX3CL1、IL-10、IL-1β的水平,CCL19亦显著升高海马中CX3CL1的水平,但对IL-10及IL-1β表达无明显影响。CUMS模型小鼠血浆中CCL19水平与对照组相比有降低趋势,CCL19腹腔注射对血浆中CCL19水平无显著影响。CUMS模型小鼠海马中CCL19水平与对照组相比有降低趋势,CCL19腹腔注射显著升高CUMS模型小鼠海马中CCL19的水平。2.趋化因子CCL19对小鼠大脑神经递质水平的影响2.1趋化因子CCL19对正常小鼠大脑神经递质水平的影响采用高效液相色谱法检测趋化因子CCL19对正常小鼠大脑氨基酸类神经递质以及单胺类神经递质水平的影响。结果表明,趋化因子CCL19对小鼠海马脑区的兴奋性氨基酸类神经递质谷氨酸和天冬氨酸的水平有降低作用,对抑制性氨基酸类神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸的水平无明显影响。CCL19对小鼠下丘脑区域的多巴胺以及去甲肾上腺素的水平皆有抑制作用,对5-羟色胺和肾上腺素水平无明显影响,提示CCL19对海马区兴奋性神经递质水平和下丘脑区多巴胺及去甲肾上腺素水平的抑制作用可能是其影响抑郁样行为的机制之一。2.2趋化因子CCL19对CUMS模型小鼠大脑神经递质水平的影响采用上述方法检测CCL19对CUMS模型小鼠大脑神经递质水平的影响。结果表明,CUMS模型小鼠海马中谷氨酸水平显著高于对照组,CCL19显著降低CUMS模型小鼠海马谷氨酸水平,氟西汀及其与CCL19合用组亦有降低CUMS模型小鼠海马谷氨酸水平的趋势。CUMS模型小鼠海马天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸水平与对照组相比无显著差异,各给药组对CUMS模型小鼠海马中上述递质水平均无显著影响。结果提示,趋化因子CCL19对海马区谷氨酸水平降低作用可能是其影响抑郁样行为的机制之一。综上所述,本研究可得结论如下:1.CCL19对正常小鼠的抑郁样行为有显著影响,对小鼠的焦虑样行为及认知样行为无显著影响。2.CCL19对CUMS模型小鼠的抑郁样行为有显著改善作用。3.CCL19对正常小鼠及CUMS模型小鼠的海马区细胞因子表达有一定影响,主要升高CX3CL1等表达,这可能是其改善小鼠抑郁样行为的机制之一。4.CCL19显著降低正常小鼠及CUMS模型小鼠海马区兴奋性神经递质谷氨酸水平,这可能是其改善小鼠抑郁样行为的机制之一。
【图文】：

示意图,水迷宫,示意图,水池

第28页3.4 六臂水迷宫实验六臂水迷宫实验仪器根据Nature protocol发表的文章设计实验（如图1）[19]。实验用的水池直径为 1 m，水池壁高出水面 30 cm，逃生平台（圆形，直径 10 cm，表面粗糙以利于动物抓住）匿藏于水面下 0.5-1 cm，水温为20℃±1℃。选用 2mm 厚度的钢板，折成 60°“V”形，“V”形边长为 30 cm。选择平滑的“V”形钢板 6 块，摆放在水迷宫的水池边缘，使其形成 6 个臂

中和抗体,趋化因子,小鼠,页图

第47页图 8 趋化因子 CCL19 及 CCL21，以及二者中和抗体对小鼠血浆细胞因子的影响Figure 8 The effect of chemokine CCL19, CCL21 and the antibody on the cytokines in plasma. n=8.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, versus control; ##P<0.01, ###P<0.001, versus CCL19; &P<0.05,&&P<0.01, &&&P<0.001, versus CCL21 by Dunnett’s post hoc test and one-way ANOVA.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R338

【参考文献】