马尔尼菲蓝状菌Tcr1、IDO1和IDO2基因功能的初步研究

发布时间：2020-06-03 00:02

【摘要】：马尔尼菲蓝状菌(Talaromyces marneffei,TM),过去称作马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM),是温度依赖性双相病原真菌的一种,也是一种条件致病菌。免疫缺陷和免疫低下的人群是高危人群。主要区域流行于东南亚和我国南方地区。它能引起严重的散播性马尔尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei,PSM),预后较差,会严重危害人体健康,但其双相转换和致病机制尚未研究清楚。色氨酸的犬尿氨酸代谢途径在病原菌感染宿主和宿主清除病原菌过程中都发挥了重要的作用。该途径关键酶是吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)。当宿主细胞高表达IDO时,能抑制体内真菌的繁殖和传播,减轻炎症反应。相反,病原真菌高表达IDO时,能躲避宿主免疫系统攻击,加重炎症。多种肿瘤细胞高表达IDO亦能躲避宿主免疫系统的清除。因此猜测马尔尼菲蓝状菌色氨酸的犬尿氨酸代谢途径与其致病机制可能有着密切的关系。近年来,越来越多的研究者关注马尔尼菲蓝状菌的双相转换机制,普遍认为其与致病性密切相关。本课题组对马尔尼菲蓝状菌标准株双相转换过程中四个不同生长时相分别进行链特异性转录组测序。比对分析发现色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径的相关基因,Tcr1、IDO1和IDO2在菌丝相转为酵母相或在酵母相时高表达。上述基因在双相转换过程中表达差异明显,故推测它们可能在马尔尼菲蓝状菌双相转换中发挥重要作用。因此本课题主要对这三个基因的功能进行初步研究,进而探究色氨酸代谢途径在马尔尼菲蓝状菌致病过程中的作用特征,为研究马尔尼菲蓝状菌双相转换机制及其致病机制奠定基础。目的:通过对致病性酵母相高表达的色氨酸代谢途径中相关的Tcr1、IDO1和IDO2基因功能的初步研究,以便阐明马尔尼菲蓝状菌中色氨酸代谢途径的特征,与双相转换的关系及其致病的可能机制。方法:利用同源重组的方法,构建目的基因缺失突变株,与出发菌株Spm4对比,主要观察基因缺失突变株表型的变化,包括对色氨酸分解代谢能力的变化,对药物、氧化压力、渗透压力和细胞壁压力敏感性的变化,检测并比较菌丝相、酵母相特异高表达基因表达量的变化,初步了解目的基因的功能。结果:(1)成功构建Tcr1、IDO1和IDO2基因缺失突变株;(2)在25℃条件下,Tcr1、IDO1基因缺失突变株无法在以色氨酸为唯一碳源和唯一氮源培养板上生长,而IDO2可在上述培养板上生长;(3)相对Spm4,Tcr1缺失突变株对渗透压力、两性霉素B和米卡芬净敏感性稍增加,另外对细胞壁胁迫压力尤为敏感;(4)相对Spm4,IDO1对两性霉素B的敏感性明显下降;(5)IDO2基因缺失突变株对两性霉素B和米卡芬净的敏感性下降。(6)IDO1和Tcr1缺失后,酵母相特异性高表达的基因(如MP1,aspergillopepsin F precursor和antigenic cell wall galactomannoprotein等)表达量相对出发菌株Spm4明显下降。结论:(1)在25℃条件下,IDO1基因在马尔尼菲蓝状菌色氨酸分解代谢过程中起主要作用,该基因还可能与细胞膜上两性霉素B固醇类结合位点的结构相关。(2)在25℃条件下,Tcr1转录因子基因参与调控色氨酸的分解代谢。该转录因子还可能影响细胞壁的组成及完整性。(3)IDO2基因不是马尔尼菲蓝状菌色氨酸分解代谢中关键基因,但可能与两性霉素B细胞膜上固醇类结合位点和米卡芬净细胞壁上葡聚糖结合位点的结构相关。(4)Tcr1和IDO1基因可能参与了酵母形态形成和维持。
【图文】：

犬尿氨酸,色氨酸,代谢途径

则会抑制病原真菌的生长和 Th17 淋巴细胞的分化、限制组织的过度炎症反应[11, 12]。在宿主和真菌都需要代谢和利用色氨酸，共享着相同的中间代谢产物，互相作用，共同影响，，它们之间是如何串扰，尚未清楚。总而言之，IDO 在真菌感染后的机体免疫反应中起着重要的调节作用，影响着感染程度。其在马尔尼菲蓝状菌感染过程中也可能发挥着重要的作用。本课题组在前期马尔尼菲蓝状菌 FRR2161 菌株转录组测序结果中，发现在 37℃致病性酵母相时色氨酸的犬尿酸代谢途径中 IDO、犬尿酸酶（kynureninase）、乙酰辅酶 A 乙酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase）和氨基羧酸缩醛半醛脱羧酶（ aminocarboxymuconate-semialdehydedecarboxylase，ACMSD）的表达大幅度上调，而犬尿氨酸氧化戊二酸氨基转移酶（kynurenine-oxoglutarate transaminase）表达下调，最终生成的犬尿酸减少，而犬尿氨酸、吡啶甲酸和乙酰辅酶 A 增加（图 1-1）。

统计图,统计图,基因,酵母

在酵母相时高表达或者是菌丝相转向酵母相时表达量增加（图1-2）。我们猜测色氨酸代谢的犬尿氨酸代谢途径与酵母细胞形态的形成和维持都发挥着重要的作用。在马尔尼菲蓝状菌基因数据库中编码发现 IDO1 基因和犬尿酸酶基因在同一个基因簇（Gene cluster）上，并在同簇基因上发现它们的编码前面有一个 Tcr1 转录因子基因，而该转录因子基因表达变化趋势同样在酵母相和菌丝相转为酵母相时表达上升（图 1-2），我们猜测该转录因子可能参与调控色氨酸的分解。而 IDO3 基因的表达量在不同温度条件下都比较稳定。图 1-2 四种生长时相中 Tcr1、IDO1 和 IDO2 基因 RPKM 变化的统计图。Figure 1-2 The RPKM value change of Tcr1、IDO1 and IDO2 gene during four phase.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R379

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