人类免疫缺陷病毒1型颗粒化衣壳蛋白展示其包膜蛋白表面环区表位的分子设计和免疫原性分析

发布时间：2020-06-03 13:03

【摘要】：人类免疫缺陷型病毒HIV自1983年被发现以来已有30多年的时间,开发有效、安全且价格低廉的预防性与治疗性艾滋疫苗及抗病毒药物仍然是预防和治疗艾滋病的首要任务。世界上各个国家的研究团队正在尝试不同的技术手段致力于艾滋疫苗的研发。随着单细胞分选和二代测序等技术的发展,从HIV感染者体内分离出了一系列超强的广谱中和抗体,通过对这些广谱中和抗体结构的晶体学分析发展出了新型免疫原设计,其中包括以HIV广谱中和抗体表位或是以保守性表位为基础的表位聚焦的免疫原设计,主要是借助外源支架或是病毒颗粒展示不同的表位递呈给机体免疫系统,旨在诱导出广谱中和抗体。本研究在先前报道的对p24突变蛋白结构及免疫原性研究的基础上,利用其可组装为颗粒、具有高度保守的序列以及大量的T、B细胞可识别的免疫优势表位的特性,以该突变型的衣壳蛋白为支架展示不同的包膜蛋白表位构建融合蛋白,探索其作为HIV表位展示载体进行免疫原设计的可能性。根据前期对p24突变体N21C/A22C蛋白结构及性质的研究,以CypA连接环为表位展示区,设计构建一系列不同Env表位的重组克隆,以实验室成熟的大肠杆菌原核表达系统表达出了不同的N21C/A22C-V3及N21C/A22C-V1V2融合蛋白,包括B亚型NL4-3与89.6和D亚型的94UG114,并通过离子层析及疏水层析纯化后获得纯度较高的各亚型的重组蛋白。利用ELISA、Western blot等手段分析其理化特征;利用流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附实验及基于免疫斑点印迹(ELISPOT)平台的TZM-bl中和检测方法评价重组蛋白的免疫原性包括多抗血清的抗体滴度、中和能力及细胞免疫应答特征。对重组蛋白反应活性及小鼠免疫原性进行检测,重组蛋白与不同的中和抗体反应性良好,并且免疫后的小鼠多抗血清可以中和不同亚型的病毒,同时又可激起免疫小鼠Thl和Th2型的细胞免疫应答。综上,本研究评价了以突变型的衣壳蛋白N21C/A22C作为载体的可行性,为以颗粒化衣壳蛋白为支架的免疫原设计提供了概念验证,可作为HIV-1疫苗研发的免疫原设计策略,同时也为后续表位聚焦的疫苗研究提供参考。
【图文】：

全球,民间社会,艾滋病毒,诊断试剂

尽管我们对艾滋病毒及其预防和治疗的科学认识有所提高，并且全球卫生和政府及民间社会组织多年来所付出的重大努力也取得了迸展，艾滋病全球总染比例呈下降走势，但在一些低收入地区仍然存在较多的艾滋病毒感染者，其一些感染者仍无法获得预防，护理和治疗，越来越多的人被诊断出患有艾滋开发快速有效的ＨＩＶ诊断试剂、对ＨＩＶ疫苗和抗ＨＩＶ药物及新型治疗方法的

示意图,示意图,糖蛋白,基序

＝＇！逡逑－－—－、，，Ｍ邋－邋Ｘ＾ｊｆ邋｛逡逑图１．５邋ＨＩＶ－ｌ蛋白结构表示和ＨＩＶ－ｌ颗粒示意图丨２６丨逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．１．５邋Ｓｕｒｆａｃｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＨＩＶ－１邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ逡逑ｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＨＩＶ－１邋ｐａｒｔｉｃｌｅ丨２６丨逡逑１．４．１邋ＨＩＶ－１包膜蛋白逡逑ＨＩＶ－１包膜（Ｅｎｖ）糖蛋白在病毒复制周期中通过介导病毒和细胞膜在进入逡逑过程中的融合而发挥重要作用。Ｅｎｖ糖蛋白被合成为多蛋白前体（ｇｐｌ６０），其被逡逑细胞蛋白酶裂解成成熟表面糖蛋白ｇｐｌ２０和跨膜糖蛋白ｇｐ４ｈｇｐｌ２０含有五个可逡逑变域（Ｖ１－Ｖ５）和五个恒定域（Ｃ１－Ｃ５）。ｇｐ４１由含有融合肽（ＦＰ），七肽重复序逡逑列（ＨＲ１和ＨＲ２）以及胞外近膜区域（ＭＰＥＲ），跨膜区（ＴＭＤ）和穿膜区．（ＣＴ）逡逑的胞外域组成，而ＣＴ包含几种基序：内化信号ＹＳＰＬ；肯尼迪序列（ｋｓ）；两亲逡逑性ａ－螺旋ＬＬＰ－１，邋ＬＬＰ－２和ＬＬＰ－３；和参与内吞和细胞内Ｅｎｖ分布的Ｃ末端二亮逡逑氨酸基序（ＬＬ）（图１．６）邋［２７］。逡逑ＨＩＶ－１邋Ｅｎｖ糖蛋白是在粗面内质网（ＲＥＲ邋）上由单一剪接的双顺反子ｖｐｕ邋／邋ｅｎｖ逡逑ｍＲＮＡ合成的多蛋白前体［２８］。未加工的Ｅｎｖ前体糖蛋白（ｇｐｌ６０）含有内质网（ＥＲ）逡逑在其Ｎ端的信号序列，从而将Ｅｎｖ靶向粗面内质网膜。该信号肽在共转录时被逡逑ＥＲ内的细胞信号肽酶除去。ｇｐ４１的跨膜结构域（ＴＭＤ）含有疏水性终止转移信＾逡逑６逡逑
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】