布鲁氏菌fliC影响巨噬细胞基因表达谱的初步研究

发布时间：2020-06-04 04:48

【摘要】：布鲁氏菌病是在世界广泛流行的传染性人畜共患病。布鲁氏菌是其致病菌,革兰氏染色为阴性,属于胞内菌。鞭毛蛋白FliC是布鲁氏菌鞭毛丝的主要组成部分,参与细菌对宿主的致病过程,是重要的病原相关分子模式之一(PAMPs)。有研究将缺失fliC基因后的布鲁氏菌通过腹腔注射感染小鼠,发现其毒力增强。但fliC缺失株感染后引发宿主细胞基因表达的变化机制还有待研究。本研究利用PCR技术及T4 DNA连接酶,通过重叠延伸PCR反应及T4 DNA连接酶连接平末端,成功构建同源重组质粒pGEM-7Zf(+)-ΔfliC。然后利用电转化手段将该重组质粒转化到布鲁氏菌M5-90株,通过PCR验证及连续传代确定其遗传稳定性,最终成功获得M5-90-ΔfliC基因缺失株。将布鲁氏菌M5-90与布鲁氏菌M5-90ΔfliC缺失株分别感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,TRIzol法提取总RNA。应用miRNA Microarray-Single芯片检测miRNAs表达谱变化,通过Agilent芯片检测基因表达谱变化。芯片实验结果发现了 15个差异倍数≥2的miRNAs及388个差异倍数≥2的mRNAs。经qRT-PCR验证后,发现10个下调的miRNAs表达量变化与芯片结果一致,分别为:mmu-miR-6965-3p、mmu-miR-328-5p、mmu-miR-7683-3p、mmu-miR-7072-5p、mmu-miR-691、mmu-miR-3070-2-3p、mmu-miR-7056-5p、mmu-miR-1907、mmu-miR-486a-3p、mmu-miR-409-3p。利用TargetScan和miRDB数据库对差异miRNA及差异mRNA表达谱进行联合分析,发现39个靶基因,再经qRT-PCR验证后,确认38个靶基因表达量与芯片结果一致,并且最终预测得到80对miRNA与靶基因的对应关系。之后选取与免疫、细胞凋亡相关基因:白细胞介素17受体Il17ra、卷曲蛋白Fzd7和促凋亡蛋白Bmf基因为研究对象。根据预测的miRNA-mRNA关系,利用miRNAmimics转染RAW264.7,通过qRT-PCR验证确定miRNAs与靶基因的对应关系,结果初步得到miRNA-预测靶基因的对应关系mmu-miR-7056-5p与Bmf、mmu-miR-328-5p与Bmf、mmu-miR-691 与Il17ra、mmu-miR-328-5p 与Fzd7。本研究为发现fliC在布鲁氏菌感染RAW264.7过程中的作用提供理论支持。
【图文】：

氏菌病疫情报道较多，其中内蒙古最为严重，其次是黑龙江、吉林和辽宁。全国逡逑人口布鲁氏菌发病报告显示，２００４年￣２０１５年，人的布鲁氏菌病发病率持续增加逡逑（图１）。通过实际调查与分析，人感染布鲁氏菌的原因有很多：不平衡集约化逡逑畜牧生产（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ邋ａｎｉｍａｌ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，，ＩＡＰ）、监督管理相关的法律法规的不健逡逑全、民众对于该病防范没有足够的认识和卫生意识（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１５）。逡逑全球总共有１７０多个国家和地区报道过人畜布鲁氏菌病，保守估计全球１４逡逑亿头牛中至少有３亿感染了布鲁氏菌（ｄｅＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏｅｔａｌ．，邋２０１５）。地中海地区，美逡逑国的南部和中部，非洲，亚洲，阿拉伯半岛、印度次大陆、中东、部分太平洋岛逡逑国都有布鲁氏菌病的报道（Ｇａｌｉｎｓｋａｅｔａｌ．，２０１３）。在一些地区，每１０，邋００，邋０００人逡逑布鲁氏菌感染率如下：沙特阿拉伯２１４．４人，伊朗２３８．６人，土耳其２６２．２人，逡逑伊拉克２７８．４人

便开始在细胞内长期生存。逡逑２．４布鲁氏菌在宿主细胞内的运输逡逑布鲁氏菌通过限制ＢＣＶ与溶酶体融合来逃避宿主细胞的破坏（图２）邋（ｄｅ逡逑Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１５）。在胞内运输过程，首先是质膜相关脂质筏（Ｐｌａｓｍａ逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｌｉｐｉｄ邋ｒａｆｔｓ）包裹布鲁氏菌形成ＢＣＶ，协助布鲁氏菌侵入巨嗤逡逑细胞。在ＢＣＶ成熟过程，先被早期内涵体抗原－ｌ（ｅａｒｌｙ邋ｅｎｄｏｓｏｍｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋１，ＥＥＡ１邋）、逡逑Ｒａｂ５标记，后被ＲＡＢ７标记。同时，ＢＣＶ的生物合成和运输受由布鲁氏菌Ｔ４ＳＳ逡逑分泌的效应蛋白的调节。在运输过程中，含有病原微生物的ＢＣＶ虽然为溶酶体逡逑相关膜蛋白邋１邋（ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，ＬＡＭＰ１）阳性，但不与逡逑含组织蛋白酶Ｄ邋（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）的溶酶体融合，进而保护了布鲁氏菌不受溶酶体逡逑降解。随着ＥＲ的结构和功能的改变
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2695914