BCG诱导小鼠树突状细胞和巨噬细胞抗原提呈功能及其机制研究

发布时间：2020-06-04 10:27

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌复合物(M. tuberculosis complex)感染引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病,每年导致大约860万结核病新发病例和130万左右患者死亡。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)作为一种1920年代发展的牛分枝杆菌(M. bovis)减毒活疫苗,目前仍然在全世界范围内用于免疫接种儿童。Ag85复合物是结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、牛分枝杆菌(M. bovis)及BCG等主要的分泌性滤液蛋白,主要包括3个组分Ag85A、Ag85B和Ag85C,大小分别为31 kDa、30kDa和31.5 kDa,大约以3：2：1的比例分泌于培养液中。Ag85复合物具有分枝酰转移酶活性,是维持分枝杆菌细胞壁完整性的重要结构。近年来研究表明,Ag85A蛋白可诱导机体产生强烈的CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答,是目前最具潜力的疫苗候选抗原之一。树突状细胞(dendritic cell, DC)和巨噬细胞(macrophage, Mφ)作为机体内单核吞噬系统主要成员,都起源于骨髓内未分化的造血干细胞,并且具有相似的免疫功能：DC和MΦ都可以吞噬入侵的病原体,通过胞内各种效应物质对其进行杀伤清除;两者都可以通过表面及胞内受体识别病原体及其组分,介导炎症反应及一系列天然免疫应答；两者都可以加工处理及提呈外源抗原,激活T细胞并诱导获得性免疫应答。但是作为机体免疫防御体系的重要组成部分,DC和MΦ针对分枝杆菌抗原的抗原提呈功能及机制还需要进入深入的研究。本文首先对Ag85A蛋白及BCG诱导机体特异性获得性免疫应答规律进行了研究；随后分别在体外及体内条件下探讨了BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ产生针对Ag85A特异性抗原提呈活性在内的一系列免疫应答功能规律；并对BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ的84种免疫相关基因转录谱进行了比较分析,为深入揭示DC和MΦ发挥抗原提呈功能的细胞及分子机制提供线索。1.牛分枝杆菌BCG Ag85A蛋白的可溶性原核表达及免疫应答特性研究通过使用冷休克表达系统和含有伴侣蛋白质粒的宿主菌,成功实现了Ag85A蛋白的可溶性原核表达,通过亲和层析纯化和Western blot鉴定,结果显示其具有较好的免疫反应性。Ag85A蛋白免疫C57BL/6小鼠后,血清中检测到高水平的IgG抗体效价,表明Ag85A蛋白可以诱导机体产生强烈的体液免疫应答。通过对特异性抗原刺激的脾脏和腹股沟淋巴结细胞分泌细胞因子进行检测,结果显示培养上清中检测到高水平的IFN-γ、TNF-α等Thl型细胞因子,而IL-4、IL-6等Th2型细胞因子的产生水平较低。另外小鼠脾脏和腹股沟淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞比值均有所上升,表明Ag85A蛋白可以诱导机体产生强烈的特异性Thl型细胞免疫应答。2.BCG、增强表达Ag85A重组BCG诱导的针对Ag85A特异性免疫应答研究BCG免疫C57BL/6小鼠后,血清中检测到高水平的Ag85A特异性IgG抗体效价,表明BCG可以诱导机体产生强烈针对Ag85A的体液免疫应答。通过对特异性抗原刺激的脾脏和腹股沟淋巴结细胞分泌细胞因子进行检测,结果显示培养上清中检测到高水平的IFN-γ、TNF-α等Thl型细胞因子,而IL-4、IL-6等Th2型细胞因子的产生水平较低。另外小鼠脾脏和腹股沟淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞比值均显著上升,表明BCG可以诱导机体产生强烈的针对Ag85A特异性Thl型细胞免疫应答。通过分枝杆菌穿梭质粒pMV261构建了增强表达Ag85A抗原的重组BCG, Western blot和ELISA实验结果显示,与BCG相比,重组BCG菌体中Ag85A蛋白含量明显增加,表明Ag85A蛋白在重组BCG中成功实现增强表达。随后对重组BCG免疫C57BL/6小鼠后诱导机体特异性免疫应答水平测定结果显示,小鼠血清中特异性Ag85A抗体水平以及脾脏和腹股沟淋巴结细胞经特异性抗原刺激后IFN-y分泌水平均显著上升,表明其可能具有更好的免疫保护效果,显示出其作为结核病疫苗研发的前景。3.BCG体外感染小鼠树突状细胞和巨噬细胞抗原提呈功能研究使用不同MOI值rBCG-GFP分别进行体外感染磁分选C57BL/6小鼠脾脏DCs和MΦs,结果显示,MΦs的感染比例显著高于DCs,表明小鼠脾脏MΦs对于分枝杆菌的吞噬能力要强于脾脏DCs。BCG感染后,小鼠脾脏DCs和MΦs胞内的ROS水平均有所上升,DCs胞内的iNOS水平有所上升,而MΦs胞内的iNOS含量似乎呈现下降的趋势。另外,MΦ胞内的ROS、iNOS和NO含量均要高于DCs,表明BCG感染后小鼠脾脏MΦs的杀伤活性要高于小鼠DCs。对BCG体外感染小鼠脾脏DCs和MΦs分泌的细胞因子测定结果显示BCG感染后小鼠脾脏DCs产生较高水平的IL-6、IFN-y和TNF-α,小鼠脾脏MΦs分泌较高水平的TNF-α和IL-10,以及一定水平的MCP-1,表明巨噬细胞在分泌炎性因子诱导炎症反应过程中发挥重要作用,而树突状细胞则侧重于启动机体T细胞免疫应答。体外抗原提呈试验结果显示,使用Ag85A多肽、Ag85A蛋白、BCG对小鼠脾脏DCs和MΦs进行刺激培养,小鼠脾脏DCs和MΦs均可以检测到特异性抗原提呈信号,且DCs的抗原提呈活性更高,表明小鼠脾脏DCs和MΦs均具有针对BCG表达Ag85A蛋白的特异性抗原提呈功能。4.BCG体内感染小鼠树突状细胞和巨噬细胞抗原提呈功能研究使用rBCG-GFP感染C57BL/6小鼠,并对小鼠体内DCs和MΦs的感染比例进行检测,结果显示rBCG-GFP尾静脉注射后,其中脾脏DC的感染比例最高达到1%-2%左右；而MΦs感染比例在48h达到3.27%。而rBCG-GFP皮下注射后,腹股沟淋巴结DCs和MΦs感染比例均随着时间的延长而不断上升,在96h感染比例分别达到2.11%和5.53%。结果表明,在感染早期,小鼠MΦs针对BCG的吞噬感染水平要高于DCs。对BCG皮下感染C57BL/6小鼠腹股沟淋巴结DC和MΦ胞内的BCG菌CFU值进行滴定,结果显示小鼠腹股沟淋巴结DCs和MΦs均感染有一定数目的BCG,在感染早期随着时间的延长胞内细菌数逐渐增多；并且MΦ胞内的细菌数要高于DC,表明分枝杆菌感染早期,MΦ对于BCG的吞噬能力要强于DC。大约7天后,MΦs胞内细菌数有所下降,并且低于DCs,结果表明DC可能并不能有效清除胞内感染的BCG,而MΦ则有着更高的清除杀伤活性。BCG感染后小鼠腹股沟淋巴结DCs和MΦs表面MHCⅡ分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子表达水平检测结果显示,在BCG皮下感染12h后DCs表面分子均呈现上调趋势,随后逐渐下降；而MΦs表面MHCⅡ和CD40分子表达水平呈现缓慢上升的趋势,但是MΦs表面上述与抗原提呈及T细胞活化相关分子的表达水平仍然低于DCs,表明BCG感染后小鼠体内只有DCs得以有效活化。对于BCG体内感染后小鼠DCs和MΦs针对BCG表达Ag85A特异性抗原提呈作用规律的研究结果显示,尾静脉注射Ag85A蛋白后,小鼠脾脏DCs和MΦs均可以检测到一定水平的抗原提呈活性信号,并且在4h后信号达到高峰。Ag85A蛋白通过皮下注射后,信号有所延迟,注射24h后检测到DCs和MΦs产生抗原提呈信号。而使用BCG皮下感染C57BL/6小鼠后,小鼠腹股沟淋巴结DCs在12-24h左右产生高水平的抗原加工提呈活性,在96h小时后信号消失,而腹股沟淋巴结MΦs则没有检测到信号。上述结果表明,在BCG体内感染早期,DCs可以对Ag85A抗原进行有效抗原提呈,并且抗原提呈信号短时间内迅速消失,而巨噬细胞没有产生特异性抗原提呈活性。5.BCG体内感染小鼠树突状细胞和巨噬细胞免疫相关基因转录谱分析本研究通过RT2 Profiler PCR Array方法对BCG皮下感染12h和48h的C57BL/6小鼠腹股沟淋巴结DCs和MΦs的84种免疫相关基因转录谱进行了比较分析。结果显示,BCG感染早期,小鼠DCs和MΦs大量基因显著上调,数目及水平均高于下调基因,表明小鼠DCs和MΦs启动一系列免疫基因的转录表达,进而发挥各种免疫应答效应；同时小鼠DCs和MΦs显著上调基因数目及变化水平随着感染时间延长而逐渐下降,表明两种细胞抗结核分枝杆菌免疫应答效应处于逐渐降低的趋势；小鼠DCs参与抗原提呈及T细胞活化的基因转录水平要高于MΦs,而MΦs表面识别受体、炎性因子基因的转录水平变化要更高,进一步证实了DCs功能侧重于抗原提呈、诱导T细胞免疫应答,而MΦs主要发挥病原吞噬杀伤、诱导炎症反应的作用。一些潜在功能相关基因的搜寻为小鼠DCs和MΦs抗原提呈功能机制的进一步研究提供了线索。
【图文】：

结核分枝杆菌在感染宿主体内的生存取决于巨枿细胞，因为巨懂细胞具有有效的抗菌逡逑能力，结核分枝巧菌具有各种机制来因对宿主的防御机制，主要是对于宿主细胞溶酶体成逡逑熟的抑制（图１）邋［１Ｄ］。包含非结核分枝杆菌病原体的吞懂体，比如大肠杆菌，吞随体将会逡逑伴随着逐渐酸化的过程从早期成熟为晚期吞枿体。晚期吞枿体的酸性环境可Ｗ促进与溶酶逡逑体的融合，另外在fi期溶酶体中活性氧和活性氮产物的产生对病原体的杀伤具有至关重要逡逑的作用。当酸性吞隆体中溶酶体酶的ｐＨ值适宜时，，将会降解吞y的病原体。但是，结核逡逑分枝杆菌通过在早期抑制吞嗟体的成熟，从而阻止吞枿细胞对其进行杀伤和降解，中和吞逡逑晚体的ｐＨ值对于抑制吞瞻体的成熟十分关键。静息巨枿细胞仅具有微弱的抗菌活性，因逡逑此巨枿细胞发挥抗菌活性需要进行诱导激活，而一些细胞因子则可Ｗ有效活化巨枿细胞。逡逑由Ｔ细胞产生的ＩＦＮ－Ｙ则是介导巨枿细胞活化的最有效细胞因子

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本文编号：2696244