PGE2对芳香化酶的调节机制及雌激素效应基因EGR-1功能研究

发布时间：2020-06-04 21:02

【摘要】：目的越来越多的证据表明,雌激素是影响良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)和前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)发生发展的重要因素之一。本实验室之前的研究发现,在前列腺间质细胞WPMY-1中,前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)能够通过上调雌激素相关受体a(Estrogen-related receptor alpha, ERRa)的表达进而促进芳香化酶的转录,由此导致雌二醇(17β-estradiol, E2)浓度的增加。其中芳香化酶是催化睾酮转化为E2的限速酶。提示,前列腺中PGE2在促进E2的生成中发挥重要的作用。ERRα作为第一个被发现的孤儿核受体,至今仍未发现其天然配体,而且对其转录活性的调节机制也尚不明确。本论文第一部分首次发现了PGE2能够激活ERRa的转录活性,并进而促进芳香化酶的表达和E2的生成。在实验室之前的研究中,我们构建了大鼠BPH模型,并使用激光显微切割联合表达谱基因芯片的方法研究单一类型细胞在BPH不同阶段的基因表达,发现早期生长反应基因-1(Early Growth Response Gene-1,EGR-1)在BPH进程中一直高表达,并且在BPH早期的上皮细胞中上调最为明显,提示EGR-1在大鼠BPH进程尤其是BPH的发生中发挥重要作用。EGR-1被发现为PCa发病关键节点基因之一,然而还尚未有报道其在BPH中的作用。本文第二部分研究了雌激素效应基因EGR-1在BPH中的生物学功能以及雌激素对EGR-1及其下游基因的调节机制。这些工作为阐明雌激素生成及其影响BPH进程的分子机制提供一些实验依据。 第一部分PGE2通过激活ERRa转录活性上调前列腺间质细胞中芳香化酶的表达 方法在WPMY-1细胞中转染ERRa表达质粒并添加PGE2,通过双荧光素酶活性方法检测ERRa反应元件(ERRa response element,ERRE)报告基因的转录。转染ERRa表达质粒或siRNA并添加PGE2, Real-time RT-PCR和Western blot检测芳香化酶的表达。在WPMY-1细胞中添加PGE2,使用荧光成像和Western blot检测ERRa蛋白胞内分布情况。在WPMY-1细胞和稳定转染ERRa表达质粒的WPMY-1细胞中分别添加PGE2、PGE2受体(PGE2receptor,EP)2拮抗剂AH6809、EP3拮抗剂L798106、EP4拮抗剂AH23848、EP2激动剂Butaprost、EP3激动剂Sulprostone、EP4激动剂Cay10580、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)抑制剂LY294002、细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)抑制剂U0126以及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活剂Forskolin,检测细胞中芳香化酶以及ERRE报告基因的表达。在WPMY-1细胞中分别添加PGE2、Butaprost、Cay10580、 Forskolin、LY294002和U0126,Western blot检测p-ERK及ERK的表达。在WPMY-1细胞中转染ERRα表达质粒并分别添加PGE2、LY294002和U0126,使用免疫共沉淀(Immunopreciptation,IP)及磷酸化蛋白染色的方法检测p-ERRα的表达。 结果无血清培养条件下,过表达ERRα并不影响ERRE报告基因和芳香化酶的表达,而当加入PGE2后,上调作用即显现。特异性siRNA沉默ERRα表达后,PGE2对芳香化酶的上调作用消失。PGE2能够促进ERRα核转移。在WPMY-1细胞和稳定转染ERRα表达质粒的WPMY-1细胞中单独加入EP拮抗剂AH6809,L798106或者AH23848并不能抑制PGE2对芳香化酶的上调效应,只有同时使用AH6809和AH23848才能抑制该效应；Butaprost、Cay10580和Forskolin能够上调ERRE报告基因和芳香化酶的表达；LY294002和U0126能够抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin对ERRE报告基因和芳香化酶的上调效应。LY294002和U0126能够抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin对ERK的磷酸化。LY294002和U0126能够抑制PGE2对ERRa的磷酸化。 结论PGE2能够激活EP2/EP4-PI3K-ERK信号通路,通过增加ERRα磷酸化以及促进ERRα核转运激活ERRα转录活性,进而上调ERRα靶基因芳香化酶的表达。 第二部分雌激素效应基因EGR-1促进前列腺增生上皮细胞系BPH-1的增殖 方法Real-time RT-PCR检测大鼠BPH组织中EGR-1表达。免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)方法检测人BPH组织中EGR-1的表达。Real-time RT-PCR检测人前列腺上皮细胞系RWPE-1及BPH-1中EGR-1表达。稳定转染构建EGR-1过表达BPH-1细胞系并使用Real-time RT-PCR和Western blot鉴定。MTT检测EGR-1过表达BPH-1细胞系增殖水平；向BPH-1细胞中转染EGR-1siRNA并使用MTT检测其增殖水平；收集EGR-1过表达BPH-1细胞系的条件培养液(conditioned medium, CM)处理WPMY-1细胞,使用MTT检测WPMY-1细胞增殖水平。在BPH-1细胞中添加E2,使用免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)及Western blot检测EGR-1蛋白胞内分布。Real-time RT-PCR和酶联免疫吸附反应(enzyme linked-immuno-sorbent assay, Elisa)检测EGR-1过表达以及siRNA、E2处理的BPH-1细胞中转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)和胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2, IGF2)的表达。Real-time RT-PCR检测EGR-1过表达BPH-1细胞系中前列腺素E合酶(prostaglandin E synthase, PTGES)和前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase1, PTGS1)的表达。 结果EGR-1在大鼠BPH组织、人BPH组织中以及BPH-1细胞系中表达增强。EGR-1过表达的BPH-1细胞增殖水平升高；特异性siRNA沉默EGR-1表达后BPH-1细胞增殖水平降低；EGR-1过表达BPH-1细胞的CM能够促进WPMY-1细胞增殖。E2能够促进EGR-1核迁移。过表达EGR-1后IGF2和TGFβ1表达水平增加；E2能够上调IGF2和TGFβ1的表达,而将EGR-1敲除后,该上调效果消失。过表达EGR-1后PTGES和PTGS1表达增加。 结论在大鼠及人BPH组织中EGR-1表达增强；EGR-1能够促进前列腺上皮细胞的增殖,还能通过旁分泌作用促进间质细胞的增殖；E2能够促进BPH-1细胞中EGR-1蛋白的核迁移进而激活其转录活性,而且EGR-1介导了E2对IGF2和TGFβ1的调控。
【图文】：

图1.2前列腺中的雌激素效应1. 1.3 ERR a在前列腺疾病中的作用1.1.3.1 ERR a研究现状雌激素相关受体a (Estrogen-related receptor alpha, ERRa)属于核受体超族，是第一个被发现的孤儿核受体，孤儿核受体是指没有天然配体的一类受[76]。ERRa 和 ERRP 是 1988 年由 Vincent Giguere 发现，以 ERa DNA 结合区(DNA-binding domain, DBD)的保守序列为探针蹄选到的两个新基因[77]，列分析表明其与ERs有很强的同源性，所以命名为ERRs，目前该家族有ERRa、ERRP和ERRy三个成员。人ERRa蛋白由423个氨基酸组成，其编码基因位染色体llql3位点；ERR(3蛋白由500个氨基酸组成，其编码基因位于染色14q243位点；ERRy蛋白由458个氨基酸组成，其编码基因位于染色体lq41位点178】。三种ERRs蛋白的DBD和配体结合区域（ligand-binding domain, LBD)

图1.3 ERs和ERRs蛋白的DBD和LBD同源性分析三种ERRs在组织分布上有特异性。ERRa的表达范围较广，在胚胎期和成体组织中均能检测到ERRa的表达，如胎盘尿囊纸膜，发育中的肾脏、心肌、消化道、骨豁、泌尿生殖器上皮、中枢和周围神经系统、和褐色脂肪组织，以及成体中的心、脑、骨豁肌、肾、睾丸肝、肺、阴道等【77，8_]。ERRP的表达水平相对较低，最早也在胚胎期就被检测到，但也只在最后发育成域毛膜的细胞中表达，ERRP在成年大鼠的肾脏、心脏、睾丸、脑、前列腺等组织中可检测到，另外在成年小鼠的肾脏和心脏中有微弱表达，，ERRP在个体发育中也发挥重要作用，ERR卩的敲除的大鼠会由于晶胚发育障碍而死亡[82_84】。ERRy在胚胎期的大脑中高表达，在肾脏和肺中也有表达，在多种成体组织如心、脑、胎盘、骨路肌、肾、胰腺、肾上腺、甲状腺、气管、脊髓、视网膜、前列腺、睾丸、小肠中都可见其表达[85’86]。1. 1.3. 2 ERR a的表达调控
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R33

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本文编号：2696970