白纹伊蚊rAlb-34k2重组蛋白对DENV-2感染BHK细胞、Raw264.7细胞调控作用的初探

发布时间：2020-06-05 04:11

【摘要】：目的:构建体外DENV-2感染BHK、Raw264.7细胞模型,探讨白纹伊蚊唾液重组34k-2蛋白(r Alb-34k2)在DENV-2感染BHK、Raw264.7细胞中可能的调控作用。方法:1)利用RTCA技术实时动态检测r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)对BHK和Raw264.7细胞增殖的影响及其对不同MOI的DENV-2感染引发细胞病变效应(CPE)的调控作用;2)利用q RT-PCR法比较不同MOI感染模型下r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)干预组与病毒对照组、热灭活蛋白组、特异性抗体阻断组之间BHK和Raw264.7细胞胞内病毒NS5基因的表达差异;3)检测不同TCID50滴度下DENV-2感染BHK细胞的半数细胞指数时间(CIT50),构建CIT50-TCID50回归方程,并利用该方程检测BHK细胞感染模型中细胞培养上清中的DENV-2滴度;4)利用q RT-PCR法分析r Alb-34k2蛋白(1μg/ml)对感染前后18h内Raw264.7细胞IFN-β/γ、IL-1β、TNF-α、IL-10、CXCL2及CXCL10的m RNA表达差异的影响。结果:1)RTCA结果显示r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)对BHK细胞、Raw264.7细胞的生长无明显影响;2)在DENV-2感染BHK细胞(MOI=0.01、0.005)、Raw264.7细胞(MOI=5、10)时,各浓度r Alb-34k2蛋白干预组均引起相应细胞增殖曲线左移增加,其中以高浓度蛋白干预组(10μg/ml)引起BHK细胞CIT50显著缩短(P0.05)、Raw264.7细胞最大CI值(CImax)下降、第45小时的CI值(CI45)显著缩短(P0.05);3)胞内DENV-2 NS5核酸检测显示:在r Alb-34k2蛋白干预后,BHK细胞、Raw264.7细胞早期胞内病毒核酸表达量均较病毒对照组增高;在BHK细胞中,以高浓度蛋白(10μg/ml)干预组升高显著,MOI=1时,分别为对照组的2.68倍(12h,P0.01)、3.63倍(24h,P0.01)、1.62倍(48h,P0.05);MOI=0.5时,为对照组的3.78倍(12h,P0.01);在Raw264.7细胞中,蛋白干预组(10μg/ml)分别为病毒感染组(MOI=5)的5.2倍(6h,P0.01)、3.5倍(12h,P0.05);且灭活r Alb-34k2蛋白组、特异性抗体阻断组均与病毒对照组无差异;4)构建RTCA标准曲线方程为y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);检测病毒含量(log TCID50/ml)的有效性和灵敏度比较:RTCA标曲法为4.90±0.05(D2)、6.27±0.15(D3)、5.99±0.17(D4),传统TCID50法为6.48±0.11(D3)、5.63±0.08(D4),两种方法检测的病毒滴度无统计差异(P0.05),但以RTCA标曲法更为灵敏。在BHK细胞感染模型中:感染第48h蛋白干预组上清中活病毒水平明显低于病毒对照组(P0.05);5)r Alb-34k2蛋白对感染前后Raw264.7细胞表达IFN-β、IFN-γ、TNF-α无影响;但可能上调感染前Raw264.7细胞IL-10、抑制CXCL10表达;并在感染后可能参与抑制IL-1β、CXCL2表达的过程。结论:1)r Alb-34k2蛋白可促进DENV-2在BHK细胞中早期增殖,并参与调控病毒的释放;2)r Alb-34k2蛋白可促进DENV-2在Raw264.7细胞中早期增殖;3)构建的CIT50-TCID50标准曲线可用于检测DENV-2的病毒滴度且灵敏度较传统TCID50法高。该实验结果为深入探讨白纹伊蚊唾液34k2蛋白在DENV-2感染靶细胞中的生物学效应提供了一定的实验依据。
【图文】：

果rAlb-34k2 蛋白对 BHK 细胞生长的影响 BHK 细胞最佳接种密度及血清维持浓度检测最佳细胞初种浓度实验结果显示：10000 cells/孔和 20000 cells/孔组曲线相似，于接种后 2-4h 进入对数生长期，10-12h 达对数生长末期，持时间约为 50h 左右，而 40000 cells/孔组生长较快，平台期维持时间为（图 1-1）；同时显微镜下观察发现：以 20000cells/孔接种细胞在培养第胞呈均匀单层，第 40-60 小时细胞呈致密单层，，无显著聚集叠加现象。以 20000 cells/孔 BHK 细胞进行血清浓度筛选发现：无血清组及 10%F维持时间短于低浓度血清组，而以 2%FBS 组 CI 值变化平缓，维持时00h 以上（图 1-2）；显微镜观察提示在同时期 5%FBS 组细胞增殖明显胞聚集叠加现象显著。

以 20000 cells/孔 BHK 细胞进行血清浓度筛选发现：无血清组及 10%F维持时间短于低浓度血清组，而以 2%FBS 组 CI 值变化平缓，维持时00h 以上（图 1-2）；显微镜观察提示在同时期 5%FBS 组细胞增殖明显胞聚集叠加现象显著。图 1-1 BHK 细胞增殖曲线Fig. 1-1 The BHK proliferation curve
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 李方站;程金芝;王涛;牟小会;颜凤;翟慧;吴家红;;白纹伊蚊唾液腺34 ku-2基因克隆与原核表达[J];中国病原生物学杂志;2015年02期

2 龚道方;周红宁;;中国登革热重要媒介白纹伊蚊的研究进展[J];中国媒介生物学及控制杂志;2009年06期

3 吴家红;;蚊虫唾液组分的抗凝血活性及其对宿主的免疫调控作用[J];中国媒介生物学及控制杂志;2008年05期

本文编号：2697487