骨髓谱系细胞中膜铁转运蛋白的缺失对铁代谢及破骨细胞分化和功能的影响

发布时间：2020-06-05 08:07

【摘要】：目的探究在骨髓谱系细胞中特异性敲除膜铁转运蛋白(Ferroportin,Fpn)对细胞铁代谢的影响以及对破骨细胞分化与功能的作用机制。方法在哺乳动物细胞中,膜铁转运蛋白是目前唯一确定的能够排出细胞铁的通道蛋白,也被称为Scl40a1。本课题研究组使用Slc40a1-floxed基因突变小鼠(购自Jackson实验动物中心),与溶菌酶M-Cre基因小鼠杂交繁育,产生一种在骨髓谱系细胞中特异性敲除Fpn基因的小鼠品系。将基因型为Fpn-flox/flox;Cre/+的小鼠命名为髓系Fpn基因敲除小鼠(Fpn~(ΔLysM)),即实验组,将杂交繁育产生的Fpn-+/+;Cre/+的同窝小鼠作为对照组(control)。通过微计算机断层扫描技术分析比较两组小鼠长骨及椎骨的皮质骨与松质骨是否有差异,并通过组织学与骨组织形态计量学进一步检测两组小鼠的破骨细胞数量与骨小梁量,证实其结果可靠性。另一方面通过血清I型原胶原N端前肽酶联免疫法测定,明确成骨细胞对两组小鼠骨量差异是否有影响。为了明确在骨髓谱系细胞中膜铁转运蛋白的缺失对铁代谢是否有影响,本实验测定了两组小鼠骨髓巨噬细胞中铁的摄入量。为了进一步明确细胞中铁量的改变对破骨细胞分化及功能的影响,本实验将两组小鼠的骨髓巨噬细胞分别培养在多孔细胞培养板与骨片上,并诱导其向破骨细胞分化,获得骨髓巨噬细胞,破骨细胞前体细胞和成熟的破骨细胞三种细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色,观察两组小鼠三种细胞在不同环境条件下,细胞形态及数量的差异情况。还通过实时荧光定量PCR检测比较两组小鼠破骨细胞相关基因的mRNA表达量的变化,应用蛋白质免疫印迹检测破骨细胞在形成分化过程中的相关蛋白质表达水平。本实验还进行了流式细胞技术测定及细胞凋亡酶联免疫吸附测定,明确两组小鼠细胞间有无增殖周期变化及细胞存活差异。为了找出是何种细胞调控机制影响了破骨细胞的形成及分化,本课题组还对破骨细胞形成过程中的两种重要细胞因子的相关调节蛋白进行了蛋白质免疫印迹检测,试图明确能够起到调控作用的细胞通路。结果在骨髓谱系细胞中特异性敲除膜铁转运蛋白会促进破骨细胞的形成并导致雌性小鼠的骨量降低,但对成骨细胞的骨形成作用无明显影响。体外实验研究表明,膜铁转运蛋白的缺失还会导致细胞铁含量轻度增加,促进骨髓巨噬细胞增殖,并增强了NFATc1和PGC-1β(两种对破骨细胞分化至关重要的转录因子)的表达,但对破骨细胞的功能及其存活无明显影响。结论在骨髓谱系细胞中特异性敲除膜铁转运蛋白,会导致细胞内铁蓄积,促进骨髓巨噬细胞增殖及破骨细胞形成,导致雌性小鼠的骨量降低。由此可见,由膜铁转运蛋白介导的细胞内的铁含量水平对破骨细胞的形成和骨量的平衡是至关重要的。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【相似文献】