白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用

发布时间：2020-06-06 23:01

【摘要】：目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测(ELISA)方法,并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检测限度,并初步应用。结果 DT含量在0~0.0160 Lf/m L范围内反应曲线线性关系良好(r0.99)。该方法与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)、百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamantous hemagglutinin,FHA)与黏着素(Pertactin,Prn)无明显交叉反应,重复性好、特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,通过验证确定的准确检测范围为0.000 8~0.016 0 Lf/m L;检测限度为0.000 8 Lf/m L。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测,同时检测了10批白喉类毒素原液与《中华人民共和国药典》三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。
【图文】：

．3．1线性范围在0～0．0160Lf/mL范围内反应曲线线性关系良好(r＞0．99)，建立方程y=100．71x+0．0825，见图2。2．3．2线性关系的重复性验证重复试验10次，10次不同时间检测的r值，结果见表1。无论r值还是r2值均＞0．99，表明实验中所建立的标准曲线具有较好的可重复性。注:1．抗DT血清1∶2;2．抗DT血清1∶4;3．抗DT血清1∶4;4．抗DT血清1∶8;5．抗DT血清1∶16;6．抗DT血清1∶32;7．NIBSC的DT标准品。图1免疫双扩散法测定DT抗血清效价Fig．1DeterminationofpotencyforDTanti-serumbyadoublediffusionmethod图2DT的双抗体夹心ELISA法标准曲线的建立Fig．2ThestandardcurveforadoubleantibodysandwichELISAindetectionDT表1线性关系的重复性验证Tab．1TheverificationrepeatabilityoflinearityfortheELISA次数rr210．9900．99520．9940．99730．9910．99540．9950．99750．9950．99760．9980．99970．9950．99780．9910．99590．9900．995100．9940．9972．3．3特异性验证双抗体夹心ELISA法检测DT抗原的特异性，见表2。对含量高的破伤风类毒素、百日咳毒素、百日咳丝状血凝素和黏着素的检测结果均为阴性，而对含量为80Lf/mL的DT检测结果微生物学免疫学进展2016年4月第44卷第2期ProginMicrobiolImmunol，Apr．2016，Vol．44No．2·47·

．3．1线性范围在0～0．0160Lf/mL范围内反应曲线线性关系良好(r＞0．99)，建立方程y=100．71x+0．0825，见图2。2．3．2线性关系的重复性验证重复试验10次，10次不同时间检测的r值，，结果见表1。无论r值还是r2值均＞0．99，表明实验中所建立的标准曲线具有较好的可重复性。注:1．抗DT血清1∶2;2．抗DT血清1∶4;3．抗DT血清1∶4;4．抗DT血清1∶8;5．抗DT血清1∶16;6．抗DT血清1∶32;7．NIBSC的DT标准品。图1免疫双扩散法测定DT抗血清效价Fig．1DeterminationofpotencyforDTanti-serumbyadoublediffusionmethod图2DT的双抗体夹心ELISA法标准曲线的建立Fig．2ThestandardcurveforadoubleantibodysandwichELISAindetectionDT表1线性关系的重复性验证Tab．1TheverificationrepeatabilityoflinearityfortheELISA次数rr210．9900．99520．9940．99730．9910．99540．9950．99750．9950．99760．9980．99970．9950．99780．9910．99590．9900．995100．9940．9972．3．3特异性验证双抗体夹心ELISA法检测DT抗原的特异性，见表2。对含量高的破伤风类毒素、百日咳毒素、百日咳丝状血凝素和黏着素的检测结果均为阴性，而对含量为80Lf/mL的DT检测结果微生物学免疫学进展2016年4月第44卷第2期ProginMicrobiolImmunol，Apr．2016，Vol．44No．2·47·

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