鲍曼不动杆菌及其喹诺酮类耐药基因的分子鉴定

发布时间：2020-06-08 15:14

【摘要】：鲍曼不动杆菌是革兰氏菌分类中的阴性杆菌,是一种条件致病菌。它不仅仅存在于医院环境内,而且分布在自然生态环境中,常引起重要的感染性疾病,例如呼吸道感染、菌血症、泌尿系统感染、继发性脑膜炎以及手术部位感染等。近现代以来,由于人们未能按照规范使用抗生素,从而导致了鲍曼不动杆菌出现耐药的情况,使得鲍曼不动杆菌引发的感染性疾病出现难以医治或无药可医的情况。近几年,人们发现耐喹诺酮类抗生素的鲍曼不动杆菌耐药菌株尤为突出。为此,我们针对鲍曼不动杆菌建立了一套可快速诊断菌种及其喹诺酮类耐药基因的体系,该体系为院内的临床诊断及治疗提供方法,以达到准确用药,及时治疗的目的。目前针对鲍曼不动杆菌的检测方法主要有手工培养+药敏试验、自动培养+药敏试验和质谱分析等方法,前两种方法存在耗费时间长、灵敏度不高等弊端。质谱分析的方法虽然快速且灵敏度高,但是该方法所用到的仪器昂贵而且需要细菌的前培养,耗时长,较为繁琐。所以本研究建立了基于PCR和LAMP法检测鲍曼不动杆菌的方法体系,且使用了PCR和多重PCR的方法对该菌中的喹诺酮类抗生素耐药基因进行检测。首先,按照“种内共有,种间特异”的原则,使用本地Blast及在线Blast的方法对鲍曼不动杆菌全基因组进行筛选,得到该菌的特异基因:CP018677.1(2912288..2912548)。针对该特异基因分别建立了PCR和LAMP检测鉴定体系。使用162株鲍曼不动杆菌及4株非鲍曼不动杆菌(铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、志贺氏菌)样本进行特异性评估,从实验结果不难看出,两种方法均可用于鲍曼不动杆菌的鉴定,特异性好。其次,分别使用梯度稀释后的特异基因阳性克隆和鲍曼不动杆菌菌液分别作为PCR反应的模板进行扩增,对鉴定体系进行灵敏度的评估,结果显示:当以阳性克隆作为PCR模板时,灵敏度可达到10~0个拷贝/反应;当以菌液作为PCR反应模板,灵敏度可达到10~1个拷贝/反应,鉴定体系灵敏度高。再其次,在耐药基因数据库(ARDB)内查找出喹诺酮类耐药基因(qnr A、qnr B、qnr S)共3种,并下载所有种类的耐药基因及其亚型,使用AlignX多序列比对软件对所下载的耐药基因序列进行多序列比对,并且针对比对的结果设计耐药基因的引物。PCR法的检测结果显示,在162株鲍曼不动杆菌临床分离株中,含有qnr A耐药基因的菌株有67株,检出率为41.36%;含有qnr B耐药基因的菌株有38株,检出率为23.46%;含有qnr S耐药基因的菌株有145株,检出率为89.51%。这与医院所给出的菌株表现型基本一致,结果准确。分别克隆出3种耐药基因的阳性质粒,10倍梯度稀释阳性质粒,并作为PCR模板,检验体系的灵敏度。结果显示qnr A、qnrS耐药基因的灵敏度均可达到10~0个拷贝/反应,qnr B耐药基因的灵敏度仍可达到10个拷贝/反应。结果说明,该鉴定体系灵敏度高。最后,将特异基因CP018677.1(2912288..2912548)和三种喹诺酮类耐药基因qnr A、qnr B、qnrS的检测组合在同一个多重PCR反应体系中。通过该多重PCR结果,我们发现该多重PCR体系可同时检测出特异基因及其所包含的喹诺酮类耐药基因,且多重PCR结果与普通PCR检测结果一致。由此可见,本次实验成功的建立了基于PCR和LAMP法鉴定鲍曼不动杆菌及其所含喹诺酮类耐药基因的方法体系,用于鉴定特异基因和喹诺酮类耐药基因的引物均为首次使用。本研究成功的建立了多重PCR体系,该体系可快速高效的检测鲍曼不动杆菌及其喹诺酮类耐药基因。
【图文】：

鲍曼不动杆菌,特异性,志贺氏菌,铜绿假单胞菌

图 2.1 PCR 法检测鲍曼不动杆菌特异性Fig 2.1 Specificity of the PCR assay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道为 DL DNA2000 marker；2-9 泳道为鲍曼不动杆菌临床分离株；10 泳道为铜绿假单胞菌；11 泳道为肺炎克雷伯菌；12 泳道为大肠杆菌；13 泳道为志贺氏菌；14 泳道为阴性对照Lane 1 was DL2000 DNAmarker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacter Baumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiellapneumoniae, Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.LAMP 法鉴定体系的特异性评估在该法鉴定特异基因的实验中，运用到的试验菌株与上述 PCR 法一样，包括：162 株鲍曼不动杆菌菌株作为实验组，，肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌及志贺氏菌各一株作为对照组。由下图可见，2-9 泳道均为鲍曼不动杆2.3.2

鲍曼不动杆菌,铜绿,特异性,质粒

图 2.2 LAMP 法检测鲍曼不动杆菌特异性Fig2.2 Specificity of the LAMPassay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道为 DL2000 marker；2-9 泳道为鲍曼不动杆菌临床分离株；10 泳道为铜绿假单胞菌；11 泳道为肺炎克雷伯氏菌；12 泳道为大肠杆菌；13 泳道为志贺氏菌；14 泳道为阴性对照Lane 1 was DL2000 marker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacterBaumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.PCR 法鉴定体系的灵敏度评估（1）以梯度稀释后的阳性质粒作为反应的模板：经由紫外分光光度计测出阳性质粒的初始浓度为 175 ng/μL，根据上述质粒个数计算公式计算出所提取的阳性质粒的个数为 5.4×1010个/μL 。首先，取 102.3.3
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378

【参考文献】