单核细胞增生李斯特菌p60蛋白异源表达条件的优化及其抑菌效果的研究
发布时间：2020-06-09 01:41
【摘要】：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)简称单增李斯特菌,是一种自然界普遍存在的人畜共患病病原菌,也是一种食源性病原菌,它能引起人、畜的李斯特菌病。食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的安全,该菌在温度较低的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。Lm-p60蛋白为单核细胞增生李斯特菌产生的一种胞外蛋白,由iap基因编码,与李斯特菌的致病性密切相关。Lm-p60蛋白具有酰胺水解酶的活性,能够水解细菌细胞壁,具有很高的研究价值。Lm-p60蛋白的三级结构预测及结构域功能的研究结果显示:Lm-p60蛋白存在着N端和C端两个独立的结构域,其中N端结构域存在两个LysM结构域和一个SH3结构域,而C端只含有一个NlpC/P60家族结构域。Lm-p60蛋白在裂解细菌细胞壁的过程中,只有N端结构域中的LysM和SH3具有结合底物功能,从而确定了 N端结构域行使识别并结合底物的功能,而C端结构域行使裂解底物功能。目前,Lm-P60蛋白是否具有抗菌性及抗菌效果如何还不是很清楚,而且Lm-p60蛋白在异源表达过程中还存在表达量不足和活性较低的问题。为了获得大量高活性Lm-p60蛋白,本研究通过SDS-PAGE分析比较不同载体构建的重组蛋白的表达量来确定最适表达载体,结果表明最适表达载体为pET30a。随后,本研究以SDS-PAGE分析和比浊法测重组蛋白裂解细菌细胞壁活性确定了以pET30a载体构建的重组蛋白最佳诱导表达条件是:在细菌培养至OD600值为0.553时加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在摇床温度为30 ℃,转速为160 rpm条件下诱导培养4 h。然后通过SDS-PAGE分析和比浊法测裂解活性确定了最佳超声波破碎时间为20 min。在最佳条件下诱导表达并用镍柱亲和层析纯化Lm-p60蛋白,通过计算后Lm-p60蛋白的纯化倍数为1.2,回收率达95%。细菌抗药性及耐药性问题日益突出,开发新的抗菌剂十分迫切。Lm-p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性,研究Lm-p60蛋白是否具有抗菌作用及抗菌效果如何成为一项重要的工作。本研究以溶壁微球菌为指示菌,琼脂打孔法确定了 Lm-p60蛋白具有抑菌活性,其抑菌效果比溶菌酶要弱。溶菌酶作为研究较为透彻的抗菌酶,其裂解细胞壁原理与Lm-p60蛋白有所不同,本研究发现,在溶菌酶中混合有Lm-p60蛋白后具有增强抑菌效果的重要结论。为溶菌酶的改造提供很好的材料。本研究还以pET30a载体构建Lm-p60蛋白的N端结构域与LysM2-C端重组蛋白。并通过比浊法测定发现N端结构域也具有裂解活性,但抑菌效果不明显,同时还发现只含有一个LysM结构域的C端重组蛋白裂解活性较弱。
【图文】：
４逦扬州大学硕士学位论文逦逡逑其由Ｐ－１，４－糖苷键将交替排列的Ｎ－乙酰葡萄糖胺（ＧｌｃＮＡｃ）和Ｎ－乙酰胞壁酸（ＭｕｒＮＡｃ）逡逑构成（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ邋ａｎｄ邋Ｋａｎｄｌｅｒ，邋１９７２；邋Ｇｌａｕｎｅｒｅｔ邋ａｌ．，，邋１９８８）。这些杂多糖聚合物的糖链是通过寡肽逡逑桥连接，从而为细菌包膜提供刚性的晶格结构（Ｒｏｌａｎｄｅｔａｌ．，２０１１）。革兰氏阳性菌与革兰氏逡逑阴性菌肽聚糖的主要不同在其肽桥上，革兰氏阳性菌其肽桥的氨基酸组成一般为Ｌ－逡逑Ａｌａ＋Ｄ－Ｇｌｕ＋Ｌ－Ｌｙｓ＋Ｄ－Ａｌａ，革兰氏阴性菌其肽桥的氨基酸组成为［－八＾＋０说１１＋１１１－０？１１１＋０－逡逑Ａｌａ邋（Ｖｏｌｌｍｅｒ邋ｅ？邋ａ／．，２００８；邋Ｖｏｌｌｍｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｅｌｉｇｍａｎ，邋２０１０）。Ｌｍ邋属于革兰氏阳性菌，但邋Ｌｍ邋细逡逑胞壁中的肽聚糖结构与革兰氏阴性菌细胞壁中的肽聚糖结构相似（Ｂｉｅｍｅ邋ａｎｄ邋Ｃｏｓｓａｒｔ，邋２００７）。逡逑Ｌｍ细胞壁中肽聚糖的结构如图１－２所示。逡逑
逦５逡逑酶与Ｌｍ－ｐ６０蛋白水解细胞壁位点不同（洛菌酶水解位点如图１－２红色箭头所示），也为溶逡逑菌酶基因工程改造提供良好的材料。逡逑１．５Ｌｍ－ｐ６０蛋白的结构域逡逑如图１－３所示，Ｌｍ－ｐ６０蛋白氨基酸序列分析预测显示：Ｌｍ－ｐ６０蛋白含有两个ＬｙｓＭ和逡逑一个８１１３结构域氨基酸基序，位于１＾末端；一个抑０（：／？６0家族结构域的氨基酸基序（１１１0证），逡逑位于Ｃ末端。逡逑Ａ邋１逦２６逦６９邋８６逦１３９逦１９９逦２４３逦３７９逦４８２逡逑逦Ｌ逦ｊ—１逦Ｕ—ｊ逦１，逦，邋■、…逡逑ＳＰ邋ＬｙｓＭｌ逦ＳＨ３逦ＬｙｓＭ２逦ＮｌｐＣ／Ｐ６０邋ｆａｍｉｌｙ逡逑栜４邋，邋S缅义希洛义希玻峰危玻叮瑰危玻罚板危咤危危咤危矗福插义希担蓿担场龋龋儒危停停取五危″邋逡诲邋尾峰义贤迹保吃げ獾牡ズ讼赴錾钏固鼐穑叮暗鞍椎慕峁褂蚝腿督峁梗ǎ伲蹂澹澹簦幔欤澹玻埃保叮╁义希疲椋纾澹保冲澹裕瑁邋澹洌铮恚幔椋铄澹铮颍纾幔睿椋幔簦椋铮铄澹铮驽澹蹋恚穑叮板澹幔睿溴澹簦瑁邋澹穑颍澹洌椋悖簦澹溴澹螅簦颍酰悖簦酰颍澹箦澹铮驽澹蹋恚穑叮啊箦澹洌铮恚幔椋睿箦澹ǎ伲蹂澹澹翦澹幔欤义希玻埃保叮╁义希ǎ粒╁澹蹋恚穑叮敖峁褂蜃槌珊拖嘤峁褂蛉督峁乖げ馔
本文编号：2703981
【图文】：
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