表达HIV-1及SIV基因的三载体疫苗免疫策略的研究

发布时间：2020-06-10 06:21

【摘要】：曾毅院士实验室主要研究治疗性艾滋病疫苗，前期提出的多载体HIV疫苗序贯和重复免疫的策略能在小鼠及恒河猴体内诱导高水平、持久的HIV特异性免疫反应。多载体疫苗中的DNA和rMVA疫苗目前正在HIV-1感染者中进行Ⅰ期临床试验，rAd5疫苗也已经申报Ⅰ期临床研究。本研究主要对上述三种载体为基础的艾滋病疫苗联合免疫的方案进行深入探讨，为申报三种疫苗联合应用的Ⅰ期临床试验提供依据。一方面对表达HIV基因的上述疫苗的免疫剂量、免疫间隔及免疫顺序等进行优化；同时，从我国CRF01_AE亚型感染者中克隆env基因，构建多载体疫苗，为与其他亚型疫苗联合应用诱导更广谱的免疫反应奠定基础。另一方面构建表达SIV gag及env基因的三种载体疫苗，采用上述优化的免疫方案先在小鼠体内进行联合免疫效果的观察，为进一步在感染SIV的恒河猴模型内进行疫苗治疗效果的评价奠定基础。表达HIV-1基因的DNA、rMVA及rAd5疫苗单独免疫后细胞免疫反应高峰均出现在免疫后2w。DNA单独免疫1次或2次以及三种不同剂量的rMVA疫苗单独免疫产生的细胞免疫反应都较弱，各组间差别不显著。三种不同剂量的rAd5疫苗单独免疫均可产生较高水平特异性细胞免疫。因而rMVA疫苗和rAd5疫苗都选择中剂量，DNA疫苗选择免疫2次。两种疫苗联合应用时，DNA与rAd5联合免疫效果优于DNA与rMVA联合。DNA与rAd5疫苗免疫间隔4w诱导的特异性细胞免疫反应强于免疫间隔3w；DNA与rMVA疫苗免疫间隔4w与3w诱导的反应水平无统计学差异。随着时间推移，各组免疫反应水平均有所下降。三种疫苗联合应用时采用DNA疫苗初免两次、间隔2w，第二种疫苗rMVA或rAd5与DNA疫苗免疫间隔4w，第三种疫苗rAd5或rMVA采用6w及4w两种不同间隔以进一步优化方案。结果第三种疫苗免疫后各组小鼠都能诱导强而且持久的Gag特异性细胞免疫反应，在末次免疫后12w仍维持在比较高的水平。总结上述研究结果为了使疫苗能更持久诱导高水平免疫反应，最佳的免疫方案为： DNA疫苗初免2次、间隔2w，再间隔4w rAd5疫苗加强免疫，间隔6wrMVA疫苗加强免疫。上述DNA和rMVA疫苗表达B′/C重组型HIV-1基因，rAd5疫苗表达B′亚型HIV-1基因。近年来，CRF01_AE亚型也成为我国的主要流行亚型，设计针对该亚型的疫苗迫在眉睫。将表达多种不同亚型的疫苗联合应用可能诱导更广谱的免疫反应。因此本研究从A/E亚型感染者的血液标本中克隆env基因，对其共享序列进行密码子优化，成功构建了DNA疫苗，能有效表达env基因。在小鼠体内能诱导高水平的细胞免疫应答。同时，也对克隆得到env序列的基因特性进行了分析。V1、V2、V4和V5区在氨基酸长度的多态性上变化较大，而V3区相对较为保守。对Env氨基酸序列中N-糖基化位点的分析显示V3，C3，C4及V5区糖基化位点的数目变化不大。gp41区的糖基化位点主要集中在跨膜区外侧的胞外功能域。还进一步构建含有上述env序列的假病毒，共获得8株滴度较高的假病毒，均为R5嗜性；检测了假病毒对5种已知广谱中和抗体和不同亚型HIV-1感染者血浆的中和敏感性。结果8株假病毒均对2G12中和抗体不敏感，对VRC_01、PG9，PG16及NIH45-46中和抗体比较敏感；对A/E及B/C亚型血浆抗体较为敏感，而对B′亚型血浆的中和敏感性较弱。该结果为研究CRF01_AE亚型疫苗的抗原特性及评价疫苗的免疫反应奠定了基础。同时，为方便评价前述三载体疫苗联合应用的治疗效果，本研究构建了表达SIV gag/env优化基因的DNA、rMVA及rAd5多载体疫苗。DNA水平和蛋白表达水平的检测结果证明，包含这两种基因的三种载体疫苗可以有效表达相应的目的基因；在小鼠体内初步的免疫效果评价表明构建的三种载体疫苗均可诱导小鼠产生相应的Gag/Env特异性细胞免疫反应。将进一步在SIV感染的猴模型中进行治疗效果的评价，，为申报临床应用提供实验依据。
【图文】：

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第1章绪论景陷病毒（HIV）概述病毒 1 型（human immunodeficiency virus type o合征（acquired immune deficiency syndrom, AIDS滋病规划署 2013 年的报告估计[3]，2012 年世界，新发感染人数仍以每年超过 200 万的数字居高者总数仍在持续增长，每年将近 160 万的感染者链 RNA 病毒，隶属逆转录病毒科慢病毒属。成熟为二十面体对称球形。电镜下观察可见致密的圆子和酶（如图 1-1）。

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避宿主的免疫控制。同时，由于 HIV 的膜蛋白 Env 结构复杂，免疫原诱导机体产生针对 Env 抗原的广谱中和抗体。由于 gp41 胞内尾区的存 Env 蛋白的低表达也被认为是 HIV/SIV 病毒免疫逃逸机制之一[15]，据 HIV 病毒刺突的数目仅约为 7-16 个[16-18]。同时 Env 蛋白中表面蛋白糖基化程度非常高，约占其分子量的 50%左右[19]，这些因素都减少了表位的暴露，使病毒得以逃避免疫系统的攻击[20]。缺乏有效的动物模型滋病疫苗研发的主要障碍之一。由于 HIV-1 无法感染猴，可以感染黑猩不致病[21, 22]，因此用其它类似的病毒感染相应宿主并致病来模拟 HIV进程是目前一个主要选择。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency ）是猴 AIDS 的致病因子，由于 SIV 和 HIV-1 有较高的同源性和相似的构，且 SIV 感染恒河猴可引起与 HIV-1 感染人类类似的病理过程和免疫4]，尽管并不能完全以SIV感染猴模型来预测和评判HIV预防性疫苗的在评价治疗性疫苗策略的有效性上还是具有一定的指导意义。4 艾滋病疫苗的主要免疫保护策略
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

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