丽沙假病毒模型的构建与优化

发布时间：2020-06-10 17:12

【摘要】：丽沙病毒(Lyssavirus)感染动物或人类引起狂犬病,狂犬病是一种动物源性传染病。丽沙病毒最初感染机体时,不进入血液循环,也无临床症状,当出现临床症状,如发热、吞咽困难、唾液过多、恐水和麻痹时,一般才被确诊。但当患者一旦发病,将无药物或疫苗可用,致死率达100%。近年来,狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡人数前列,丽沙病毒给人民群众生命健康及公共卫生带来严重威胁。丽沙病毒是典型的囊膜病毒,表面G蛋白是参与病毒进入宿主细胞的唯一因子,而与病毒G蛋白作用的宿主细胞膜表面受体目前尚不明确。此外,虽然已知丽沙病毒进入宿主细胞是pH依赖的内吞过程,但此类病毒仍与其他pH依赖的囊膜病毒不同(如甲型流感病毒、HCV、丝状病毒等)。本课题组主要从事病毒进入抑制剂的发现及机制研究,前期也已发现了一些丝状病毒、冠状病毒和沙粒病毒的进入抑制剂,建立以丽沙病毒G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒模型,将有助于研究这些抑制剂的作用机制。此外,由于丽沙病毒受体的复杂性和对氢离子浓度的敏感性均有自身的特点,发现丽沙病毒进入抑制剂,将有助于理解此家族病毒的进入机制,并且对目前仍无药可用的丽沙病毒药物研发也有提示作用。基于上述目的,本论文针对最早确定的7种基因型丽沙病毒构建了以G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒。这7 种病毒分别为 Rabies lyssavirus(RABV)、Lagos bat lyssavirus(LBV)、Mokola lyssavirus(MOKV)、Duvenhage lyssavirus(DUVV)、European bat 1 lyssavirus(EBLV-1)、European bat 2 lyssavirus(EBLV-2)和 Australian bat lyssavirus(ABLV)。针对上述7种病毒,本论文首先构建了病毒表面糖蛋白G的表达质粒,考察G蛋白在真核细胞中的表达,然后将G蛋白质粒与敲除外壳基因并带有荧光素酶报告基因的HIV-1核心质粒共转293T细胞,两种基因表达并包装生成lyssavirus-G/HIV假病毒,随后优化了假病毒的包装条件,最后考察了假病毒的感染性。结果显示,所构建的7种病毒(RABV、ABLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、LBV和MOKV)的表面糖蛋白表达质粒均可在293T细胞中有较高表达,其中有6种病毒(DUVV、EBLV-1、EBLV-2、RABV、LBV 和 MOKV)的 G 蛋白能够与HIV-1核心包装成具有感染性的病毒。通过优化去除G蛋白羧基端His标签后,RABV和MOKV假病毒感染能力提高100倍。随后,本论文又通过优化GP质粒与HIV核心质粒的转染总量及比例确定假病毒的包装条件,结果显示,6孔板最佳质粒转染总量为2 μg,假病毒最佳质粒转染比例分别为DUVV-G:HIV-luc =1:8;EBLV-1-G:HIV-luc =1:8;EBLV-2-G:HIV-luc =1:8;MOKV-G:HIV-luc =1:8;RABV-G:HIV-luc=1:4,LBV-G:HIV-luc=1:16。优化后的假病毒(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc 和RABV-G/HIV-luc)感染293T细胞信号值均超过1×106RLUs,且感染的病毒量与荧光素酶相对活性呈相关性。最后,本论文检测了丽沙病毒对不同种属、不同组织来源细胞的感染性,结果显示:人源细胞系中,A549(肺癌细胞系)、U87MG(胶质母细胞瘤细胞系)和293T(肾细胞系)对多数丽沙病毒易感,信号值均超过了 1×106RLUs,此结果与丽沙病毒的嗜神经性和组织分布特性相符。仓鼠肾细胞系(BHK-21)也对大多数丽沙病毒易感,提示啮齿动物有作为丽沙病毒宿主的可能性。综上所述,本论文应用假病毒技术建立了 6种丽沙假病毒模型(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc和RABV-G/HIV-luc),并利用这6种丽沙假病毒对不同种属、不同组织来源细胞的感染性进行了初步研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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