白介素24融合蛋白的表达、纯化和促伤口愈合功能的鉴定

发布时间：2020-06-14 00:48

【摘要】：本研究通过优化小鼠白介素24(mIL-24)基因序列,构建以Fc-tag为标签的mIL-24-Fc融合蛋白.对CHO进行MTX分级加压筛选,获得了稳定、高表达mIL-24-Fc蛋白的阳性克隆,同时优化了CHO细胞无血清驯化与稳定表达蛋白体系.经protein A亲和层析纯化mIL-24-Fc蛋白并利用AP binding实验检测生物学活性后,小鼠皮内注射mIL-24-Fc蛋白和伤口愈合实验证明:注射mIL-24-Fc蛋白后,小鼠表皮产生2~3层细胞增生,伤口愈合速度加快.
【图文】：

石蜡包埋获得小鼠背皮切片，通过ＨＥ染色后观察小鼠背部组织．３结果３．１ｍＩＬ－２４－Ｆｃ重组质粒的构建及鉴定优化后的ｍＩＬ－２４基因约为７００ｂｐ，将基因合成后得到的ｐＵＣ５７－ｍＩＬ－２４质粒，用ｈｉｎｄⅢ和ＢｇｌⅡ限制内切酶双酶切连接到Ｆｃ－Ｔａｇ载体上（图１Ａ）．其测序结果与插入基因序列完全一致，同时用Ｆｃ－Ｔａｇ载体上特异性引物Ｌ－ＡＰ和Ｒ－Ｆｃ进行质粒ＰＣＲ鉴定（图１Ｂ），得到相当大小的ＰＣＲ产物．图１ｍＩＬ－２４－Ｆｃ质粒的构建（Ａ）ｍＩＬ－２４－Ｆｃ质粒结构示意图；（Ｂ）ｍＩＬ－２４－Ｆｃ重组质粒ＰＣＲ鉴定结果．目的条带大小约为７００ｂｐ．Ｆｉｇ．１ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｍＩＬ－２４－ＦｃＰｌａｓｍｉｄ（Ａ）ｐｌａｓｍｉｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉａｇｒａｍｏｆｍＩＬ－２４－Ｆｃ．（Ｂ）ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｍＩＬ－２４－Ｆｃ．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｔｒａｐｓｉｚｅｉｓ７００ｂｐ．３．２ｍＩＬ－２４－Ｆｃ蛋白纯化ｍＩＬ－２４蛋白的Ｃ端融合了Ｆｃ－Ｔａｇ，因此ｍＩｌ－２４－Ｆｃ蛋白样品可以通过ｐｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析柱进行亲和层析，再将纯化蛋白超滤至ＰＢＳ缓冲液中保存，再用１０％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分离纯化前的样品、穿透液中的样品和纯化后的样品，考马斯亮蓝染色分析结果表明，，原液中的杂蛋白经ｐｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析柱纯化后得到高纯度的洗脱回收液，同时穿透液中未见目的蛋白，说明目的蛋白均挂上了层析柱（图２）．３．３ＡＰｂｉｎｄｉｎｇ

等量ＰＢＳ，从Ｄａｙ０开始拍照观察直至ｄａｙ９．图５表明，Ｄａｙ３开始，ＰＢＳ组和实验组伤口均缩合，ＰＢＳ组伴有出血但实验组已止血．Ｄａｙ５开始ＰＢＳ结痂，而实验组痂已退去表皮恢复平整．Ｄａｙ９开始实验组伤口已变小，而实验组还是痂期．４讨论银屑病的主要病理改变是表皮增生，角质化和真皮炎细胞浸润．白介素１０家族在银屑病中的地位暗示了白介素２４研究的可观性．ｍＩＬ－２４在原核表达系统中表达为包涵体，变性复性困难，本实验图４ｍＩＬ－２４－Ｆｃ实验小鼠背皮ＨＥ染色．分别于２０×和４０×物镜下观察结果Ｆｉｇ．４ＨＥＳｔａｉｎｉｎｇｏｆＭｏｕｓｅＳｋｉｎ．Ｖｉｅｗｅｄｕｎｄｅｒ２０×ａｎｄ４０×ｌｅｎｓ４３９

【参考文献】

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【共引文献】

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本文编号：2712004