结核病新型预防性疫苗的构建策略研究

发布时间：2020-06-14 04:53

【摘要】：[背景目的] 结核病(Tuberculosis, TB)目前作为传染性疾病中的第二号杀手,严重威胁着人类健康；而现有唯一可用的疫苗——卡介苗(Mycobacterium bovis BCG),仅能为未成年儿童提供可靠的保护性,因此急需发展可用于成人的新型预防性疫苗。BCG初免-异源性疫苗增强(BCG prime-Heterologous Boost)策略以及重组卡介苗(RecombinatBCG)策略是现阶段认为最有希望的两种免疫策略。因此,阐明这两种策略的保护性差异,对于未来结核病疫苗的研制工作具有指导意义。本研究拟构建一株分泌表达融合蛋白ESAT-6-Ag85A的重组卡介苗(rBCG::685A)并证实其正确表达。拟以BCG初免-DNA疫苗pcD685A增强为初免增强组,与rBCG::685A分别免疫小鼠后,比较这两种策略的免疫原性及保护性。 [方法] 1.用BamH I及EcoR I酶切真核质粒pcD685A,获取融合基因ESAT-6-Ag85A,将其亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌分泌型载体pMS261,构建含有融合基因序列的重组质粒pM685A,并经测序验证序列正确； 2.通过电击法将pM685A质粒导入感受态BCG中国株,通过Kan抗性筛选阳性克隆,并经Western-blotting证实蛋白的正确表达； 3.将rBCG::685A及BCG初免-pcD685A增强按照各自策略分别免疫C57BL/6小鼠,以PBS为阴性对照,BCG为阳性对照。8周后,分离脾细胞经ELISA检测PPD及抗原r685A特异性IFN-γ浓度。通过qRT-PCR检测肺脏IFN-γ、TNF-α、IL-10以及iNOS的表达情况； 4.免疫8周后,用1×106CFU剂量的M.tb H37Rv经尾静脉攻击感染。4周后处死小鼠,分别检测肺脏及脾脏荷菌量；同时取右肺部分组织切片后进行常规HE染色及Ziehl-Neelsen抗酸染色,并对病理改变进行评价。 [结果] 1.携带融合基因ESAT-6-Ag85A的穿梭质粒pM685A被成功构建,通过酶切鉴定及基因测序证实。 2.通过Western-blotting证实在rBCG::685A培养上清中有38kDa的r685A蛋白表达,表示分泌表达融合蛋白的重组卡介苗rBCG::685A被成功构建。 3.不同疫苗免疫小鼠8周后,ELISA检测小鼠脾细胞培养上清中特异性IFN-γ水平：经PPD及r685A刺激后,所有免疫组相对于PBS对照组均产生较高水平的IFN-γ (P0.05):r685A特异性刺激后,BCG初免-pcD685A增强免疫组产生的特异性IFN-γ水平相对于rBCG::685A免疫小鼠明显升高(P0.05)。 4.对免疫小鼠肺脏不同分子表达谱进行qRT-PCR检测：与PBS组比较,IN-γ TNF-α、IL-10以及iNOS在不同免疫组小鼠肺脏中表达水平均上升；与BCG组相比较,BCG初免-DNA疫苗增强免疫组以及rBCG免疫组免疫小鼠肺脏IFN-γ及IL-10表达水平略有上升；而BCG初免-pcD685A增强免疫组小鼠肺脏TNF-α及iNOS水平相对于BCG组和rBCG::685A组小鼠显著上升(P0.05)。 5.免疫小鼠经M.tb H37Rv攻毒4周后,分析小鼠脏器荷菌量：BCG初免-DNA疫苗增强免疫组小鼠体内荷菌量最低(P0.05),而rBCG::685A组小鼠体内荷菌量与BCG组比较无统计学差异(P0.05)；病理切片镜下观,BCG初免-DNA疫苗增强免疫组小鼠肺脏组织病理改变最轻：BCG组和rBCG::685A组中可见散在血管周围炎及肺泡炎,但相对于PBS组明显减轻。 [结论] 1.BCG初免-pcD685A增强策略诱导产生的免疫反应及保护效应明显优于rBCG::685A: 2.未来成人结核病疫苗的合理设计需要以BCG或有效的增强型rBCG菌株为初免疫苗、联合异源性疫苗增强策略的保护作用,最终有效的控制TB的发生。 [背景目的] BCG作为唯一的结核病预防疫苗,能较好地预防婴幼儿和儿童的结核性脑膜炎及粟粒样结核,但是对预防成人结核病的能力有限。前期通过初免增强策略及rBCG策略的比较性研究,我们证实BCG初免-异源性增强策略是一种有效地改善BCG保护性的手段。因此,急需发展一种合适的BCG初免后的增强疫苗,以提高其对成人结核病的预防效果。已通过大量动物试验及临床研究证实,亚单位蛋白疫苗可能是一种较为有效的预防结核病的疫苗类型；结合M.tb致病性的研究,发现M.tb在体内的致病性可分为不同阶段,并在不同阶段表达的抗原谱具有阶段特异性；BCG免疫针对其中某些阶段的特异性抗原无或弱应答。我们假设选择M.tb不同阶段表达的抗原构建融合蛋白亚单位疫苗,有可能建立针对感染者体内不同状态M.tb的免疫保护性,从而既能控制M.tb的原发感染的发病,也能够控制成人结核病的发生。因此,本研究拟选用M.tb感染后各阶段特异性蛋白为靶抗原,设计一条表达多阶段抗原的融合蛋白A1D3R1,联合新型佐剂MTO制成亚单位蛋白疫苗A1D3R1/MTO,评价其免疫小鼠的免疫原性及保护效果。 [方法] 1.基因设计和合成：M.tb H37Rv基因组涉及的五个基因及各自的序列,分别是：Ag85A、Rv2626c、Rv3407、PhoY2以及RpfB,然后使用分子生物学相关软件对序列进行分析和融合,并命名为A1D3R1。设计好的A1D3R1序列交由公司合成并测序正确。同时设计特异性PCR引物。 2.原核表达载体的构建,蛋白表达、纯化和定量：构建表达菌株E. coliBL21(DE3)-pET30b-A1D3R1.诱导表达融合蛋白A1D3R1,通过Ni-NTA亲和柱方法纯化获取原核蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western-blotting验证,通过BCA法定量及去除内毒素后用于后续实验。 3.全血IFN-γ释放试验鉴定抗原能否被M.tb感染人群和未感染人群的T细胞所识别：收集人群血液样本,结合临床诊断及本课题组前期建立诊断标准将人群进行分类[46]。用WBIA方法测定融合蛋白A1D3R1及各亚组分蛋白刺激产生的特异性IFN-γ水平。 4.亚单位疫苗A1D3R1/MTO的免疫原性分析：融合蛋白A1D3R1联合新型佐剂MTO(主要包括海藻糖6,6’-二分枝菌酸和单磷酰脂质A)构建亚单位疫苗A1D3R1/MTO,并免疫小鼠；同时设置PBS阴性对照组、佐剂MTO组及BCG阳性对照组。免疫9周后进行免疫学分析：收集血清并检测血清中特异性抗体及其亚类滴度；无菌分离脾细胞,加入特异性抗原及对照,刺激后检测培养上清中抗原特异性细胞因子,包括：IFN-γ、TNF-α及IL-2;收集脾细胞并刺激后,通过流式细胞术对脾脏不同类型淋巴细胞进行分型。 5.亚单位疫苗A1D3R1/MTO免疫小鼠抗M.tb H37Rv的短期保护性评价：小鼠免疫9周后,用M.tb H37Rv毒株攻击感染。每天监测小鼠生存状态,以绘制幸存率曲线；4周后处死小鼠,分别检测肺脏及脾脏中荷菌量；同时取左肺上叶部分组织进行常规HE染色及Ziehl-Neelsen抗酸染色,并进行组织病理学评价。 [结果] 1.成功构建、表达并纯化融合蛋白A1D3R1： 1)成功构建原核表达载体pET30b-A1D3R1,并经酶切鉴定及DNA凝胶电泳证实产物片段大小正确； 2)成功表达融合蛋白A1D3R1,纯化过程经SDS-PAGE凝胶电泳证实其表达及纯化结果,通过Westem-blottig证实纯化蛋白具有较高的纯度及生物活性。 2.A1D3R1及亚组分蛋白能被中国M.tb感染人群T细胞识别并刺激产生高水平的IFN-γ:通过临床指征初筛结合rCM-WBIA界定人群后: 1)融合蛋白A1D3R1及其亚组分蛋白均可被中国M.tb感染者的T细胞所识别； 2)总人群及感染人群经AlD3R1刺激后,均诱导产生显著高于亚组分蛋白Rv3407、PhoY2、Ag85A及Rv2626c的IFN-γ水平(P0.05)(RpfB除外)。 3.亚单位疫苗能诱导产生良好的Thl型免疫应答： 1)亚单位疫苗免疫小鼠血清中产生高水平的A1D3R1特异性IgG抗体及其亚类,且趋向Thl型反应; 2)亚单位疫苗免疫小鼠脾细胞分泌高水平的A1D3R1特异性细胞因子IFN-γ、 TNF-α和IL-2； 3)亚单位疫苗免疫小鼠脾细胞PPD或A1D3R1抗原特异性总IFN-γ+分泌型CD4+或CD8+T细胞数量显著升高； 4)亚单位疫苗诱导脾细胞中PPD或A1D3R1特异性的IFN-γ+IL-2+分泌型CD4+T细胞数显著上升； 5)亚单位疫苗诱导脾细胞中PPD或A1D3R1特异性的IFN-γ+、IFN-γ+IL-2+以及IFN-γ+TNF-α+分泌型CD8+T细胞数显著上升。 4.亚单位疫苗诱导产生较好的抗结核保护效果：经M.tb H37Rv攻毒4周后,A1D3R1/MTO组脏器荷菌量相对于PBS组和MTO组显著下降(P0.05),但仍高于BCG组小鼠(P0.001)；病理切片镜下观,病理改变较PBS及MTO组明显减轻；短期幸存率达到83.33%。 5.佐剂MTO免疫小鼠能产生一定水平的免疫保护性：MTO组小鼠脾细胞经刺激后,能产生显著高于PBS组的IFN-γ及TNF-α(P0.05);流式细胞术检测证实MTO组小鼠经刺激后主要产生显著高于PBS组的IFN-γ+单阳的分泌型T细胞,以及IFN-y+IL-2+双阳的分泌型CD4+T细胞(P0.05);抗结核病保护效应优于PBS组,且短期幸存率达到83.33%。 [结论] 本研究所构建亚单位疫苗A1D3R1/MTO经动物模型证实具有抗结核分枝杆菌急性感染的免疫保护性,其免疫保护性可能与特异性CD4+Th1型应答相关；进一步分析证实主要诱导产生特异性IFN-y+IL-2+双阳的分泌型CD4+T细胞,以及IFN-γ+、 IFN-γ+IL-2+;和IFN-y+TNF-a+双阳的分泌型CD8+T细胞。同时,也证实我们发明的MTO佐剂,能够诱导以分泌IFN-γ和TNF-α为主的Th1型免疫应答,为进一步用于疫苗研究评价奠定了基础。 【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

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