阿托伐他汀通过Nrf2信号通路对实验性脑梗死小鼠模型的脑保护作用及其机制研究

发布时间：2020-06-14 08:51

【摘要】：脑梗死又称为缺血性脑卒中,是由于供应脑部的血流中断,导致脑组织缺少氧气和葡萄糖供应,而引起的局灶性组织坏死和软化,其特点发病率高、致残率高、致死率高、复发率高。中国导致过早死亡损失寿命年(YLLs)最高的原因是卒中。随着全球人口老龄化日益严重,缺血性脑卒中的发病率逐年增高,且有年轻化的趋势,已成为世界上最重要的健康问题之一。虽然静脉溶栓治疗是目前恢复脑血流供应的最重要的措施,但治疗时间窗较窄、禁忌证较多、有一定的出血风险,大部分患者不能应用。因此,如何预防脑梗死的发生,梗死发生后如何减轻继发性的脑损伤成为我们重要研究课题之一。脑梗死时机体产生的自由基会导致氧化应激反应的加剧,减少自由基的产生,寻找抗氧化应激药物对预防和治疗缺血性脑卒中有重要意义。阿托伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶的选择性、竞争性抑制剂,具有多种作用:降低胆固醇合成,进而反馈性增强细胞表面低密度脂蛋白(LDL)受体的表达;抑制极低密度蛋白胆固醇(VLDL-C)合成;减少脂质浸润和泡沫形成,减少动脉粥样硬化斑块的体积,诱导动脉粥样硬化斑块逆转,从而改善缺血;抑制巨噬细胞趋化因子表达和分泌,阻止单核细胞及其它炎性细胞浸润,从而发挥抗炎作用;改善血管内皮功能等,特别是其抗脂质过氧化作用,通过清除自由基,降低斑块内LDL的氧化易感性,在缺血性脑卒中后发挥了重要的脑保护作用。但阿托伐他汀抗氧化的分子机制目前尚不十分明确。我们的前期研究表明阿托伐他汀可以上调实验性脑梗死小鼠大脑皮层核转录因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)的表达。NRF2属于Cap-n-collar(CNC)转录因子家族,包括6个高度保守的结构域Nrf2-ECH homology(Neh)。它是细胞氧化应激反应中的重要因子,在细胞质中受Keap1的调控,激活后,与Keap1解离,入核后通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)相互作用,调控抗氧化蛋白和II相酶类的表达。自噬是一种受溶酶体控制的可以清除受损或老化细胞的现象,使细胞在多重应激状态下,保持内稳态,得以生存。许多因素会影响自噬,包括氧化应激、内质网应激、老化等,也有很多研究表明缺血性脑卒中后会有自噬的调节和改变。本课题选用8~12周龄健康雄性ICR小鼠为研究对象,采用电凝法制备远端大脑中动脉闭塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型。在本课题中,主要研究阿托伐他汀是否改善脑缺血后神经功能损伤,抗氧化应激作用,对自噬的调节,以及Nrf2信号通路及其下游相关因子是否参与其中。本课题分为三部分,各部分内容概述如下。第一部分阿托伐他汀对实验性脑梗死小鼠模型的神经功能恢复、脑保护作用目的:观察给予阿托伐他汀后实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损、脑梗死体积、脑含水量、脑血流量的变化,研究阿托伐他汀对实验性脑梗死小鼠的神经保护作用。方法:选用8~12周龄健康雄性ICR小鼠为研究对象,采用电凝法制备dMCAO模型。实验一:将ICR小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham):动物接受假手术和等体积的生理盐水;手术组(Vehicle):动物接受dMCAO和等体积的生理盐水;阿托伐他汀低剂量组(AtorvL):动物接受dMCAO,并给予10 mg/kg阿托伐他汀;阿托伐他汀中剂量组(Atorv-M):动物接受dMCAO,并给予20 mg/kg阿托伐他汀;阿托伐他汀高剂量组(Atorv-H):动物接受dMCAO,并给予40mg/kg阿托伐他汀。术前7天开始每日给予阿托伐他汀灌胃直至取材,分别于术前、术后24小时、48小时、72小时对各组小鼠进行RotaRod、mNSS神经功能评分,同时测量体重变化。实验二:将ICR小鼠随机分为以下各组:手术组(Vehicle)和阿托伐他汀中剂量组(Atorv),于术后72小时用TTC染色法测定脑梗死体积,干湿重法测定脑组织含水量,于术前、术后即刻、24小时、72小时使用激光散斑成像仪监测脑血流量(CBF)。结果:1.Rota-Rod实验结果显示:除Sham组以外,在术后24小时、48小时、72小时,与Vehicle组相比,Atorv-M组均明显改善了神经功能损伤(P0.01),Atorv-L组与Vehicle组相比仅术后72小时表现较好(P0.05),Atorv-H组在术后48小时、72小时均好于Vehicle组(P0.05),但Atorv-M组与Atorv-H组在48小时、72小时相比,神经功能恢复较好(P0.05)。2.mNSS结果显示:在术后24小时、48小时,Vehicle组和Atorv各组之间均没有显著差异。在术后72小时,Atorv-M组与Vehicle组、Atorv-L组小鼠的神经缺陷评分差异有显著性(P0.05),与Atorv-H组没有显著性差异。余各组之间mNSS评分在各时间点均无显著性差异。体重变化结果显示:接受手术后各组小鼠的体重在24小时、48小时、72小时均有下降,然而,五组之间的差异无统计学意义(P0.05)。根据行为学实验结果,我们选择阿托伐他汀20 mg/kg进行后续实验。3.TTC染色结果显示:在dMCAO后72小时,Atorv组小鼠的脑梗塞体积显著小于Vehicle组(P0.01)。脑含水量测定结果显示:在dMCAO后72小时,Atorv组小鼠脑含水量明显高于sham组(P0.05)、但明显低于Vehicle组(P0.01)。4.激光散斑脑血流量测量结果显示:小鼠术后左侧大脑半球的脑灌注量下降至约95%,但在右侧大脑半球脑灌注量立即明显下降至约55%(P0.01)。右侧皮层大脑中动脉供血区,脑灌注量随着时间逐渐恢复,atorv组小鼠较Vehicle组恢复更快,但两组小鼠之间脑灌注量各时间点均未无明显差异。第二部分阿托伐他汀对实验性脑梗死小鼠模型氧化应激损伤的保护作用及对自噬相关因子的影响目的:观察给予阿托伐他汀钙后实验性脑梗死小鼠脑组织各氧化应激指标的变化,Nrf2的表达水平以及自噬相关指标LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1的表达水平。方法:选用8~12周龄健康雄性ICR小鼠为研究对象,采用电凝法建立dMCAO模型。将ICR小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham),Vehicle组(Vehicle)和阿托伐他汀组(Atorv)。实验一:于术后72小时取材测定SOD、MDA、CAT、GSH的含量。实验二:于术后72小时取材应用Western Blot的方法测定胞浆、胞核Nrf2蛋白的表达水平。实验三:于术后72小时取材应用Western Blot的方法测定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1的表达水平。结果:1.各组小鼠同侧大脑皮层中SOD、CAT、GSH的含量检测结果显示:脑缺血后72小时,Atorv组与Sham组、Vehicle组相比,SOD的含量明显增加(P0.01),Sham组与Vehicle组小鼠SOD含量无显著差异。Atorv组较Vehicle组相比,CAT明显增加(P0.01),GSH含量也明显增加(P0.05),Atorv组与Sham组小鼠CAT、GSH含量无显著性差异(P0.05)。2.各组小鼠同侧大脑皮层中MDA的含量检测结果显示:脑缺血后72小时,Vehicle组与Sham组、Atorv组小鼠相比,MDA的含量明显增加(P0.01)。Atorv组较Sham组相比,MDA的含量虽有升高,但差异无统计学意义(P0.05)。3.Western blot结果显示:在术后72小时,各组胞浆Nrf2蛋白的表达均无显著差异(P0.05)。与Sham组相比,Vehicle组、Atorv组胞核Nrf2蛋白表达显著增加(P0.01)。Atorv组胞核Nrf2蛋白表达较Vehicle组显著增加(P0.05)。4.Western blot结果显示:在术后72小时,LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值Atorv组较Sham组、Vehicle组均升高(P0.01),Beclin1的表达水平Atorv组较Sham组、Vehicle组均升高(P0.01),Sham组与Vehicle组相比LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、Beclin1的表达水平均无显著性差异。第三部分阿托伐他汀通过Nrf2信号通路发挥抗氧化应激作用的相关机制研究目的:通过测定各组小鼠神经功能评分、脑梗死体积及Nrf2信号通路相关因子表达水平,观察Nrf2信号通路是否参与了阿托伐他汀对实验性脑梗死小鼠的抗氧化应激作用。方法:采用8~12周龄成年雄性野生型ICR小鼠(Nrf2+/+)与以ICR为背景的Nrf2敲除小鼠(Nrf2-/-)为研究对象,通过电凝法建立dMCAO模型。将Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠分别随机分为以下3组:假手术组(Sham)、Vehicle组(Vehicle)和阿托伐他汀组(Atorv)。于术后72小时进行Rota-Rod、mNSS神经功能评分,TTC染色法测定脑梗死体积,试剂盒测定SOD活力,通过Western Blot测定HO-1、NQO-1、P62的表达。结果:1.所有小鼠均进行基因型鉴定,鉴定结果出现一条400 bp左右条带,为纯合子,Nrf2-/-小鼠;出现750 bp和400 bp条带,为杂合子,即Nrf2+/-小鼠;出现一条750 bp左右条带,为野生型,即Nrf2+/+小鼠。2.Rota-Rod结果显示,在术后24小时、48小时、72小时,阿托伐他汀处理的Nrf2+/+小鼠神经功能缺损均明显轻于其余各组(P0.01),阿托伐他汀处理的Nrf2-/-小鼠神经功能缺损仅在72小时较Nrf2-/-Vehicle组小鼠有差异(P0.01),但仍明显较阿托伐他汀Nrf2+/+小鼠恢复慢(P0.01)。mNSS评分结果显示:术后24小时各组小鼠评分均无显著性差异,术后48小时、72小时,Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠评分阿托伐他汀组均低于Vehicle组。3.SOD活力检测结果显示,在术后72小时,Nrf2+/+Atorv组小鼠梗死侧皮层SOD活力显著高于其他各组(P0.01),其余各组间差异无显著性。4.Western blot结果显示:在术后72小时,Nrf2+/+Sham组HO-1含量明显低于其余各组(P0.01),Nrf2+/+Atorv组HO-1含量明显高于其余各组(P0.01),余各组间无显著性差异。Nrf2-/-Sham组NQO1含量明显低于其余各组(P0.01),Nrf2+/+Atorv组NQO1含量明显高于其余各组(P0.01),余各组间无显著性差异。Nrf2+/+Atorv组P62含量较Nrf2+/+Sham组、Nrf2+/+Vehicle组升高(P0.01),而Nrf2-/-Atorv组P62含量较Nrf2-/-Sham组、Nrf2-/-Vehicle组降低。结论:1.本实验成功在健康雄性ICR小鼠建立电凝法局灶性永久脑梗死模型,成功建立起Nrf2-/-小鼠的繁殖鉴定技术。发现阿托伐他汀20 mg/kg灌胃可以显著改善小鼠的神经功能缺损表现,减少脑梗死体积,减轻脑水肿,阿托伐他汀20 mg/kg给药具有脑保护作用。2.阿托伐他汀干预可以改善小鼠缺血半暗带区脑血流灌注量,具有抗氧化应激作用。3.阿托伐他汀可以上调自噬相关基因,可能通过激活自噬发挥抗氧化应激作用。4.阿托伐他汀干预可以通过激活Nrf2信号通路,上调该通路下游基因HO-1、NQO-1的表达,发挥抗氧化作用,从而改善脑缺血小鼠的神经功能恢复,P62蛋白水平的上调可能与Nrf2的激活形成正反馈有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3;R-332
【图文】：

神经功能缺损,阿托伐他汀

图 1 阿托伐他汀减轻脑卒中后神经功能缺损Fig.1 Atorvastatin reduces neurologic deficit after stroke(A) The rota rod apparatus. (B) Rota-rod test and mNSS assessment. (C) were performed atindicated time points to evaluate neurological deficit (n = 12). (D) The changes of bodyweight were monitored during the experiment procedure (n = 12). Quantitative data areshown as mean ±SEM,★P < 0.05,★★P < 0.01 vs. Vehicle group.

阿托伐他汀,脑水肿

图 2 阿托伐他汀减小脑卒中后脑梗死体积，减轻脑水肿Fig.2 Atorvstatin relieved brain infarct volume and brain edema after stroke(A) The TTC staining of sham, vehicle and atorv groups at 72 hours after stroke. (B)Quantification of TTC staining brain slices (n = 6). (C) The brain water content test, at 72hours after stroke, brain water content was significantly lower in Atorv-treated mice than invehicle-treated mice (n = 6). Quantitative data are shown as mean ±SEM, P ＜ 0.05, P ＜0.01 vs. Vehicle group.

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