人脐带间质干细胞来源外泌体在急性皮肤光损伤中的作用及机制

发布时间：2020-06-16 01:03

【摘要】：目的:随着臭氧层空洞日益加剧,人们接触紫外线(UV)明显增多,长期接触过量UV易导致皮肤晒伤、光老化及肿瘤发生。据报道人脐带间质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hucMSC)条件培养基能保护UV损伤,延缓皮肤衰老。外泌体(exosome)是hucMSC旁分泌关键成分,大量存在其条件培养基中。然而,hucMSC-exosome(hucMSC-ex)对皮肤UV损伤作用未见报道,本文旨在探讨hucMSC-ex能否防治UV所致皮肤损伤及其作用机制。方法:组织贴壁法分离hucMSC,成脂和成骨诱导实验鉴定hucMSC分化潜能;30%蔗糖密度梯度超滤离心法分离hucMSC-ex,蛋白质印迹分析其表面标记,透射电镜观察其形态和大小,Nanosight检测其粒径分布和浓度;hucMSC-ex预处理暴露皮肤,UVA和UVB辐照法制作SD大鼠急性光损伤模型,大体观、HE和免疫组化等方法分析其防护效果;Western Blot检测组织蛋白PCNA、p-NF-κB和TNF-α表达,免疫组化和荧光检测组织8-OHDG和γH_2AX表达;共聚焦显微镜检测PKH-67标记hucMSC-ex被HaCaT细胞内化情况;UVB和H_2O_2建立HaCaT氧化损伤细胞模型,免疫荧光分析hucMSC-ex对活性氧自由基(ROS)表达影响;细胞免疫荧光检测PCNA和Caspase3表达量;Western Blot检测H_2O_2作用后HaCaT细胞增殖、凋亡、炎症情况,qRT-PCR分析HaCaT细胞SIRT1和TNF-α表达情况;Western Blot检测对照组和过表达14-3-3ζ组exosome中14-3-3ζ和SIRT1表达情况;过表达14-3-3ζexosome(ad-14-3-3ζ-ex)与H_2O_2共处理HaCaT细胞,免疫荧光、Western Blot和qRT-PCR检测SIRT1表达情况;应用过表达14-3-3ζ腺病毒转染HaCaT细胞,免疫荧光和Western Blot检测细胞SIRT1表达变化。结果:茜素油红O染色阳性;Exosome表达CD63和CD9,电镜下为“杯状”结构,Nanosight分析其直径在100nm左右;对照组皮肤光滑细腻、状态健康,而模型组皮肤明显红肿、脱屑、粗糙;HE显示对照组皮肤分层清晰,无病理变化,而模型组表皮细胞大片坏死,部分仍黏连,分层紊乱。真皮大量炎细胞浸润,网织纤维肿胀变性,而hucMSC-ex组表皮红肿、脱屑明显减轻,细胞坏死脱落明显减少,炎细胞浸润较少。DNA损伤产物显著减少,p-NF-κB水平显著下调,PCNA明显上调;hucMSC-ex在HaCaT胞质中富集,ROS和8-OHDG显著减少,Bax、p-NF-κB、TNF-α明显下调,PCNA、Bcl2显著上调;氧化应激条件下HaCaT细胞SIRT1表达呈时间和剂量依赖性下调,而hucMSC-ex处理组SIRT1则显著高表达;过表达14-3-3ζexosome(ad-14-3-3ζ-ex)显著上调HaCaT细胞SIRT1水平,促进自噬活化,减少DNA损伤和细胞凋亡;过表达14-3-3ζ腺病毒转染HaCaT细胞显著促进SIRT1表达。结论:HucMSC-ex携带14-3-3ζ促进HaCaT细胞SIRT1上调,减少ROS产生和DNA损伤,促进自噬活化发挥细胞保护作用,缓解UV和H_2O_2诱导的氧化损伤。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2;R594.11
【图文】：

免疫调节作用,并激,炎症反应,伤口

江苏大学硕士学位论文抗炎细胞因子 IL-10 来缓解炎症反应[62]。同时越来越多文me 也能通过特定的 miRNA 发挥免疫调节作用。Ti 等人发现 LPSme 携带的 miRNA-let-7b 可通过抑制 TLR4/NF-κB 途径并激活 ST从而抑制慢性炎症反应并促进皮肤伤口愈合[63]。通过分析 miRNA hucMSC-exosome 高表达三种 miRNA（ miRNA-21 ，miRNA1c），研究表明携带 miRNA-181c 的 hucMSC-exosome 通过下调 T烧伤诱导的过度炎症[64]。综上所述，MSC-exosome 能通过多种不应进而缓解皮肤的炎症程度并促进伤口的愈合。

皮肤细胞,成纤维细胞,皮肤再生,鼠模型

图 1.3.2 MSC-exosome 促血管形成机制[22]C-exosome 促进皮肤细胞增殖和再上皮化段通常在皮肤损伤后的第 3d 开始。此后，成纤维细胞出现并开始（ECM），包括纤连蛋白，I 型和 III 型胶原蛋白。此外，上皮细区域的边缘迁移，从而加速伤口闭合，减少皮肤感染。因此，细胞对皮肤再生至关重要。以前的研究表明，来自不同来源的 exosom血浆（PRP），hiPSCs 和 hucMSC 都可以促进皮肤细胞增殖并加速上鼠模型中，PRP 衍生的 exosome 通过激活 YAP 有效促进成纤维细速再上皮化[75]。此外，人类成纤维细胞衍生的 exosome 含有具有质和 miRNA，这些 exosome 通过诱导皮肤细胞的增殖和迁移来加合[76]。 MSC-exosome 是一种理想的治疗工具，因为它们具有丰富和储存，安全性和有效性增加以及免疫原性较低。已广泛报道 MSC

【参考文献】