醋氨酚诱导肝细胞损伤中JNK信号通路与GSTA1的作用研究

发布时间：2020-06-16 15:17

【摘要】：药物性肝损伤,已经成为中国急性肝衰竭发生的主要原因之一。醋氨酚(Acetaminophen,APAP),又称对乙酰氨基酚,是一种最常用的解热镇痛药物,常被用于感冒药中。过量服用醋氨酚造成的肝病在药物性肝病中占据最大比例。谷胱甘肽S-转移酶A1(GSTA1)是一种药物代谢Ⅱ相酶,能催化醋氨酚的有毒代谢产物N-乙酰对苯亚胺醌(NAPQI)与谷胱甘肽(GSH)的结合,提高细胞对抗氧化应激和抵抗外来毒物的能力。c-Jun氨基末端激酶(JNKs)属于丝裂原活化蛋白激酶家族,JNK信号通路可被多种刺激激活,在细胞因子、UV照射、热休克等外界刺激作用下,其上游蛋白MKK4和MKK7使JNK上Thr183、Tyr185磷酸化,JNK入核并激活下游底物c-jun,进而影响细胞凋亡或分化。本课题以HepG2细胞为对象,建立醋氨酚诱导的不同程度的药物性肝细胞损伤模型,研究醋氨酚诱导的肝细胞损伤中JNK信号通路与GSTA1的作用与关系,为进一步认识药物性肝损伤的损伤机制及保护机制奠定理论基础。本试验采用不同浓度的醋氨酚处理HepG2细胞,通过检测培养上清液中转氨酶(ALT、AST)活性来判断肝细胞损伤程度,确定出可以造成不同程度肝细胞损伤的作用浓度,复制药物性肝细胞损伤体外模型。在该模型的基础上通过检测转氨酶活性筛选JNK抑制剂SP600125(SP)的最适作用浓度。随后研究醋氨酚诱导的肝细胞损伤中JNK信号通路相关蛋白的变化与JNK信号通路对GSTA1的影响。细胞随机分为六组:对照组、不同浓度的APAP组(6 Mm、8 mM)、6 mM APAP+SP组(6 mM APAP+2μM SP600125)、8 mM APAP+SP600125组(8 mM APAP+2μM SP600125),抑制剂对照组(2μM SP600125)。应用试剂盒检测培养上清中转氨酶(ALT、AST)活性和肝细胞生化指标水平;采用Western blot方法测定肝组织中JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun、c-fos、p-c-fos、ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4和GSTA1的蛋白相对表达量;采用Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡。通过以上研究,明确在APAP诱导的药物性肝细胞损伤中JNK信号通路是否被激活,探讨其与GSTA1表达之间的关系。研究结果表明:1、应用梯度浓度APAP作用HepG2细胞6 h可对肝细胞造成不同程度的损伤。当作用浓度为6 mM时,上清液中ALT和AST活性均显著升高(p0.05);当作用浓度为8 mM时,ALT和AST活性均极显著升高(p0.01)。最终确定以6 mM和8 mM为APAP作用浓度,复制不同程度肝细胞损伤的模型。2、在肝细胞损伤模型的基础上,筛选出JNK抑制剂SP600125的最适作用浓度为2μM。3、SP600125作用于肝细胞损伤模型后,与8 mM APAP组相比,8 mM APAP+2μM SP600125组ALT和AST活性均极显著下降(p0.01),肝细胞指标均极显著变化(p0.01);与6 mM APAP组相比,6 mM APAP+2μM SP600125组ALT、AST活性显著下降(p0.05),肝细胞指标均显著变化(p0.05),表明SP600125能减轻APAP造成的氧化损伤。4、JNK信号通路上下游蛋白的表达结果表明,与对照组比较,不同浓度APAP组中p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值均升高(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125组p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值显著低于6 mM APAP组(p0.05);8 mM APAP+2μM SP600125组p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值极显著低于8 mM APAP组(p0.01)。不同剂量APAP组中p-c-fos/c-fos比值均高于对照组(p0.05);抑制JNK的活化不会降低p-c-fos/c-fos比值,c-fos可能有其他通路激活参与药物性肝细胞损伤过程。以上结果说明JNK信号通路在APAP诱导的不同程度的药物性肝细胞损伤中均被激活;抑制JNK的活化能使APAP诱导损伤的肝细胞中JNK、c-jun磷酸化水平下降(p0.01),但c-fos磷酸化水平没有变化,SP600125能显著抑制转录因子c-jun的活化,而JNK上游蛋白ASK1和MKK4磷酸化水平不因JNK磷酸化被抑制而发生明显变化,表明APAP诱导的药物性肝细胞损伤中由c-jun介导的细胞凋亡被SP600125抑制,而其他细胞信号通路介导的凋亡未发生显著性变化。5、GSTA1蛋白表达结果显示,6 mM和8 mM APAP组中GSTA1相对表达量均极显著低于对照组(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125组GSTA1相对表达量显著高于6 mM APAP组(p0.01);8 mM APAP+2μM SP600125组GSTA1相对表达量极显著高于6 mM APAP组(p0.01)。APAP诱导的肝损伤中GSTA1表达量减少,JNK被SP600125抑制后肝细胞中GSTA1表达量升高,说明JNK信号通路的激活可以减少肝细胞内GSTA1的蛋白表达。6、Hoechst 33342检测凋亡结果表明,随着APAP浓度的升高,细胞发生凋亡的趋势越明显,细胞核浓染成明亮蓝色荧光,出现明显的核固缩;JNK激活被SP600125抑制的肝细胞中,细胞凋亡现象明显减少,未见大量核浓染或核碎裂现象。说明在APAP诱导的药物性肝细胞损伤中,HepG2细胞凋亡增加,而抑制JNK活化通路能减少由APAP引起的HepG2细胞的凋亡,表明在APAP诱导的肝细胞损伤中JNK信号通路激活能够显著增加肝细胞的凋亡。本研究成功复制APAP诱导的肝细胞损伤模型,并确定JNK抑制剂SP600125的最适作用浓度。在APAP诱导的肝细胞损伤中,JNK抑制剂SP600125处理APAP诱导的药物性肝细胞损伤模型,肝细胞损伤和氧化应激被减轻。JNK被SP600125抑制时,下游底物c-jun的磷酸化减少,肝细胞中GSTA1的表达量提高。确定JNK信号通路在APAP诱导的肝细胞损伤中被激活,JNK信号通路参与调控药物性肝细胞损伤中GSTA1的表达,但其机制仍需进一步深入研究。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965;R-332
【图文】：

药物性,肝细胞损伤,浓度,活力

分析导肝细胞损伤模型的复制 HepG2 细胞药物性损伤模型复制的试验中，不同浓度的ALT 和 AST 活性变化如图 3-1 和图 3-2。结果显示，与对理后，培养上清中 ALT 和 AST 活性均显著升高（p<0.05AST 活性均极显著升高（p<0.01）。在 APAP 浓度分别为和 AST 活力升高程度不同。因此，选择 APAP 浓度为 6 m细胞损伤模型。

浓度,活力,对照组,和图

ALT 和 AST 活性变化如图 3-1 和图 3-2。结果显示，与对理后，培养上清中 ALT 和 AST 活性均显著升高（p<0.05AST 活性均极显著升高（p<0.01）。在 APAP 浓度分别为和 AST 活力升高程度不同。因此，选择 APAP 浓度为 6 m细胞损伤模型。比 p<0.05；**表示与对照组相比 p<0.01 不同浓度 APAP 对细胞培养上清 ALT 活性的影响（ x ±s 3-1 The changes of ALT activity in culture supernatant ( x ±s

【参考文献】