在T细胞中特异敲除RACK1对γδT细胞和NKT细胞的影响

发布时间：2020-06-18 04:26

【摘要】：目的:检测RACK1基因在T细胞中特异性敲除对小鼠γδT细胞和NKT细胞胸腺内发育、外周比例和数量的影响;并分析对感染免疫、炎症损伤的影响。方法:采用Cre-LoxP系统条件性敲除T细胞中的RACK1基因,得到RACK1在T细胞中特异缺失的小鼠(KO小鼠,同窝对照小鼠称为WT小鼠)。观察李斯特菌感染后,WT小鼠和KO小鼠死亡率及其肝脾的载菌量有何差别。使用流式细胞术检测CD3、CD4、CD8、γδTCR、Vγ1、Vγ2等,检测胞内因子IL-17的表达。构建嵌合体小鼠,将CD45.1~+CD45.2~+的WT小鼠骨髓单个核细胞与CD45.1~-CD45.2~+的KO小鼠骨髓单个核细胞以1:1的比例通过尾静脉注射,打入清髓后的CD45.1小鼠体内,分析两种来源的γδT细胞在完全相同环境下,是否仍呈现一些方面的差异。利用Con A诱导建立小鼠急性肝损伤模型,观察在WT和KO小鼠中,其死亡率、肝脏HE染色以及血清转氨酶表达水平的高低。利用流式细胞术检测CD3、NK1.1、CD1d-tetramer等,以及检测胞内因子TNF-α、IFN-γ的表达水平,分析WT小鼠和KO小鼠在这些方面有何差异。结果:1、KO小鼠在受到李斯特菌的感染后,死亡率以及肝脾的载菌量计数与WT小鼠相比均有不同程度的下降。而KO小鼠中γδT细胞的百分比和绝对数相比于WT小鼠都大幅度升高。进一步使γδT细胞的亚群Vγ1、Vγ2以及分泌的IL-17的绝对数显著升高。2、嵌合体小鼠的数据证明,来自于KO小鼠的γδT细胞并没有显著升高。3、KO小鼠中CD3~+CD1d-tetramer~+iNKT发育障碍,Con A诱导小鼠急性肝损伤模型表明,KO小鼠的死亡率远低于WT小鼠,且HE染色中证明了KO小鼠的肝损伤非常有限。而血清中AST和ALT的水平测定同样证明了WT小鼠的肝脏损伤更为显著。4、表面marker染色证明了KO与WT小鼠相比,Con A诱导后,肝脏中传统T细胞的百分比和绝对数量都大幅度减少,而CD3~+NK1.1~+NKT细胞和CD3~-NK1.1~+NK细胞的百分比和绝对数没有变化;胞内因子染色证明了IFN-γ在T细胞、NKT细胞以及NK细胞中的比例和绝对数也都明显下降,TNF-α却没有显著变化。5、通过纯化小鼠脾脏传统T细胞,利用Con A在体外刺激后,发现IFN-γ的表达并没有缺陷。结论:在小鼠模型中,证明了虽然KO小鼠外周传统T细胞中的CD8~+T细胞比例和绝对数大幅度减少,但是小鼠清除细菌的能力并没有由此而减弱,甚至更强。RACK1基因的敲除对外周γδT细胞的百分比和绝对值存在影响。构建嵌合体证明了在KO小鼠中,外周γδT细胞的增加是由于环境外在缺陷所导致的。而RACK1在T细胞中的特异性缺失,不仅使外周传统T细胞中的百分比和绝对数出现了大幅度的减少,而且导致CD3~+CD1d-tetramer~+iNKT细胞发育障碍。Con A诱导后,RACK1在T细胞中的特异性缺失对肝脏起到了一定的保护作用。在特异性缺失RACK1的传统T细胞中,Con A注射后IFN-γ的表达减少,可能是由于肝脏内部的微环境改变所致。在体外刺激外周传统T细胞,RACK1并不直接影响IFN-γ的表达。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

序列,T细胞,特异性,表示基

题组早期构建。表达的重组酶能够介导 LoxP 序列的因的条件性敲除。re 是在 T 细胞中条件性敲除基因的常用 cre，它在 T高达 90%，是研究基因与 T 细胞发育关系的理想我们能够看到是否具有两个 LoxP 序列，以及 Cre 酶。以下的结果表明（如图 1.1 所示），在基因水平上，基因在 T 细胞中特异性敲除的小鼠。其中 F/F 表示基xP 序列，F/+表示杂合子，F/－表示基因两端都没有Cre+表示该小鼠具有 CD4-Cre酶，CD4-Cre-则表示没有

致死剂量,死亡率,小鼠,细胞的

特菌后的 7-10 天为 CD8+T 细胞的反应峰值，因此特殊说明，均在李斯特菌感染 7-8 天检测，所采用量为 5×105CFU/只，活化感染剂量为 1×105CFU/只。采用致死剂量的李斯特菌以尾静脉注射的方式鼠和 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小鼠死亡率的情况。前re小鼠 CD8+T 细胞的数量大幅度减少，CD8+T 细胞体内保护性免疫减弱，死亡率应该高于 Gnb2l1F/F小示），我们看到 Gnb2l1F/F小鼠从第 3 天开始死亡，到了 60%。而 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小鼠的死亡率不过只致了 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小鼠在 CD8+T 细胞的数量大幅却低于正常野生小鼠呢？

【相似文献】