登革病毒空壳疫苗研制及病毒空壳制备关键技术

发布时间：2020-06-20 07:37

【摘要】：登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一种流行于热带与亚热带的RNA负链病毒，属于黄病毒科黄病毒属。通过蚊子的叮咬，四个亚型的登革病毒交替传播。人类在感染登革病毒后会引起登革热(Classic Dengue Fever, DF)，当第二次遭受不同亚型感染以后，先前存在的非中和抗体不但起不到免疫保护作用，反而携带入侵机体的病毒感染靶细胞，使机体发生严重的登革出血热(Dengue Hemorrhagic Fever,DHF)或终身不愈的登革休克综合症(Dengue Shock Syndrome, DSS)，甚至死亡，这种现象被称为抗体依赖增强(Antibody dependent enhancement,ADE)。至今，全世界有许多种登革病毒疫苗被加以研究，但由于ADE现象的存在导致目前没有任何登革疫苗被批准上市。鉴于ADE现象导致严重疾病的机理还无法彻底阐明，以及登革病毒感染后的交叉保护机制也并不清楚，所以理想的登革病毒疫苗应能激发机体对四种亚型登革病毒都产生免疫保护力。在能抵抗四种登革病毒感染的同时，登革病毒疫苗还应具有可以激发长效、安全的免疫应答与免疫保护的能力。目前对登革病毒疫苗开发的重心集中在如何提高疫苗所激发的中和抗体水平，以及降低ADE现象的问题上。登革病毒的表面蛋白E蛋白(Envelope portein)携带有主要中和抗体表位，而且E蛋白所激发抗体的ADE活性要低于免疫完整病毒所激发抗体的ADE活性。但是由于亚单位疫苗本身特性所决定，基于E蛋白开发的亚单位疫苗的效果并不理想。本文的目的是开发一种新型登革病毒疫苗，在具备完全病毒疫苗可以激发良好免疫应答能力的前提下降低引发ADE现象的风险，而且研究结果应该既要有作为疫苗应用的潜力，又可为更深一步的研究奠定基础。基于以上预期设想，本文采取了以病毒空壳来作为疫苗应用实验思路。通过物理方法去掉登革病毒的病毒核心颗粒后，将携带病毒表面蛋白的登革病毒包膜重建为与天然病毒空间结构一致的病毒空壳。通过细胞水平实验与动物水平实验，鉴定登革病毒空壳的免疫原性以及所激发抗体的ADE的活性，为登革病毒疫苗的开发提供新的方向，也为研制4价登革病毒疫苗打下基础。本文主要工作可分为研制登革病毒空壳疫苗与解决病毒空壳制备过程中关键技术两个部分。工作主要内容涉及了登革病毒空壳免疫原性研究，以及制备病毒空壳过程中的三个关键问题，共四部分内容： 1. DENV-2病毒空壳免疫原性研究。利用DENV-2制备了DENV-2病毒空壳，并对病毒空壳进行理化性质鉴定，以及生物活性鉴定。利用DENV-2病毒空壳免疫小鼠，对病毒空壳所激发的细胞免疫以及体液免疫进行评价。对登革病毒空壳激发免疫应答能力的评价结束后，本文在细胞水平上对DENV-2病毒空壳免疫后血清做了中和抗体活性的评价，同时也对免疫后血清的ADE的活性做了评价。由于登革病毒没有致病生物模型，本文通过2日龄乳鼠颅内接种的方法对免疫后血清做了免疫保护能力评价。 2.建立规模化登革病毒制备与纯化方法。由于制备病毒空壳需要较大数量的高纯度的病毒作为原材料，本文驯化并筛选了低血清培养的单克隆Vero细胞系，在优化了病毒培养条件的同时，摸索了双水相萃取法纯化登革病毒的条件，在不利用超速离心方法的前提下，可一次性制备大量高纯度病毒。 3.建立规模化登革病毒空壳制备方法。筛选了用于制备病毒空壳的常见去污剂，并对病毒空壳制备的条件进行了优化，解决了目前制备病毒空壳所用去污剂过于昂贵，以及无法大量制备病毒空壳的问题。 4.解决了病毒空壳无法进行生产的问题。建立了登革病毒空壳制备的操作工艺，并且进行了中试生产，解决了病毒空壳难以生产为产品的问题，使登革病毒空壳疫苗规模化生产成为可能。在DENV-2病毒空壳免疫原性研究工作部分中，取得的结果主要包括DENV-2病毒空壳激发体液免疫能力、激发细胞免疫能力、所激发抗体的病毒中和活性与ADE活性等内容，结果显示DENV-2病毒空壳在保留了天然DENV-2病毒免疫原性的同时，降低了引发ADE现象的可能。在解决病毒空壳制备过程中存在的关键问题的工作部分中，本文建立了可规模化制备并纯化DENV-2的方法、可规模化制备DENV-2病毒空壳的方法，同时设计了一套DENV-2病毒空壳的中试生产工艺，并成功进行了中试。现将本文所取得的主要结果介绍如下： 1. DENV-2病毒空壳激发免疫应答能力。本文首次将病毒空壳技术应用在登革病毒上，成功的制备了登革病毒空壳。同时对DENV-2病毒空壳进行了激发免疫应答能力的研究、抗体中和活性及ADE活性的研究、以及产生免疫保护能力研究等免疫原性研究。结果显示，本文所制备的登革病毒空壳在外观上呈现与天然病毒一致的颗粒状，只携带了登革病毒的表面蛋白E蛋白。同时所制备的DENV-2病毒空壳在体外可与天然DENV-2病毒竞争宿主细胞表面的受体，其受体封闭效率BA50达101.7(LogBA50=1.7)。说明病毒空壳在入侵宿主细胞能力上与天然病毒功能一致。在免疫应答研究结果中显示，DENV-2病毒空壳可激发与天然病毒一致的抗体应答，在只含有E蛋白的前提下，DENV-2病毒空壳所激发的IgG抗体滴度(Log10)可达3.56，与天然病毒平均激发的3.62相似。对所激发IgG中IgG1与IgG2a亚型研究结果显示，DENV-2病毒空壳所激发的IgG抗体中IgG1浓度与免疫天然病毒所激发抗体相似，但是IgG2a浓度却比天然病毒所诱导的略高，说明DENV-2病毒空壳更倾向于诱导IgG2a。病毒空壳更倾向于激发IgG2a的产生，预示着免疫DENV-2病毒空壳有可能比免疫完全病毒更有利于后期体内病毒的清除，对感染后病毒血症的消除也将会更加有利。在细胞免疫应答研究中，天然登革病毒可激发较高水平IFN-γ及IL-4阳性T细胞产生，但IFN-γ阳性细胞要高于IL-4阳性细胞，这意味着免疫天然病毒或自然感染状态下机体免疫反应会倾向Th1的应答，而Th1/Th2的应答不平衡也正是一些疫苗造成免疫损伤的原因。当免疫DENV-2病毒空壳后，IFN-γ及IL-4的阳性T细胞水平都较低，这一方面说明只含有E蛋白的病毒空壳比完全病毒刺激细胞免疫应答的能力较弱，但另一方面也显现出免疫病毒空壳后所引发免疫损伤的机率较小的优势。 2. DENV-2病毒空壳所激发抗体的病毒中和能力与ADE活性。将DENV-2病毒空壳与天然病毒免疫Balb/C小鼠后，对免疫小鼠血清做了中和抗体活性以及ADE活性研究。结果显示，DENV-2病毒空壳所激发的抗体与天然病毒所激发的抗体具备相似的中和能力，其中DENV-2病毒空壳诱导的抗体在中和50%DENV-2感染能力(50%Focus Reduction Neutralizing Test, FRNT50)时的滴度为102.314(LogFRNT50=2.314)，与天然DENV-2所激发抗体的中和能力相似(LogFRNT50=2.389)。在对DENV-1感染时的中和实验结果显示，DENV-2病毒空壳所激发抗体的中和能力(LogFRNT50=1.696)也与天然DENV-2一致(LogFRNT50=1.717)。对免疫后血清增强DENV-1感染能力的研究结果中显示，病毒空壳所激发抗体在高浓度时的ADE活性较天然病毒所激发抗体略强，这推断是由于在高浓度抗体情况下，天然病毒所激发的中和抗体与非中和抗体都对病毒感染产生了阻碍作用。当随着抗体浓度的降低，免疫DENV-2天然病毒所激发抗体的ADE活性迅速增强，最高可使DENV-1增加56％的感染能力，而免疫DENV-2病毒空壳后，抗体的ADE活性此时没有随着抗体浓度的降低而迅速增加，最高使DENV-1感染能力增加46％。通过对免疫后抗体的中和活性以及ADE活性的结果分析显示，免疫DENV-2病毒空壳后可激发与DENV-2天然病毒一致的中和抗体，但ADE活性却较免疫天然病毒抗体有所降低。 3. DENV-2病毒空壳所激发抗体的免疫保护能力。由于缺乏致病动物模型，本文对免疫保护能力的研究采用了在体外将抗体与病毒孵育，再对乳鼠进行颅内注射的方法对免疫保护能力进行评价。结果显示，当将免疫DENV-2病毒空壳血清与DENV-2在体外孵育1h后再进行颅内注射，大部分小鼠可以存活，并没有发生神经性病变。对乳鼠保护实验结果进行统计分析，免疫DENV-2病毒空壳后血清可抵抗5×104PFU和1×105PFU两个滴度的DENV-2感染，1:40及1:80稀释的免疫血清都可以对乳鼠产生免疫保护能力。在5×104PFU和1×105PFU的DENV-1感染实验组中，1:80稀释的DENV-2病毒空壳免疫血清对小鼠的保护力减弱，1:40稀释的免疫血清组还具有免疫保护能力。结果说明DENV-2病毒空壳免疫后，对DENV-2的感染有较好的免疫保护能力，在抗体浓度较高的情况下，对DENV-1的感染也具有良好的免疫保护作用。 4.规模化登革病毒制备与纯化方法建立。本文通过低血清驯化方法得到了在2％血清浓度下生长的单克隆Vero细胞系。通过鉴定及筛选制备了2％低血清浓度下生长的用于培养登革病毒的单克隆Vero细胞系。所建立的细胞系细胞复苏效率达90.8％，培养时生长状态稳定，传代周期为3d。在培养DENV-2病毒时，细胞生长丰度为80％，病毒接种量为0.05-0.1个MOI时可进行质量稳定的病毒大规模培养，病毒培养时间为72-96h，收毒后病毒滴度为4×105PFU/mL。本文利用硫酸铵与PEG1000建立双水相体系，通过萃取方法可将DENV-2及PRRSV两种不同病毒从含病毒细胞培养上清中萃取到富含PEG1000的上相。病毒原液经过双水相萃取纯化并浓缩后，体积浓缩至原体积的20.9％。蛋白电泳检测无杂蛋白，通过TCID50检测病毒滴度达106.7TCID50/mL，PFU滴度达7×106PFU/mL。本文所建立的硫酸铵/PEG1000双水相体系可成功应用于登革病毒的大规模浓缩与纯化。 5.规模化登革病毒空壳制备方法建立。用HNE缓冲液调整病毒蛋白浓度为2mg/mL后用终浓度0.3mg/mLTriton X-100对病毒颗粒进行裂解，通过Sepharose4FF分子筛层析分开溶解的病毒包膜与病毒核心，再经超滤透析去除Triton X-100后病毒空壳可自动组装。所制备的病毒空壳磷脂回收率为68.5％，蛋白回收率为58.6％，蛋白/磷脂比为1.84, Triton X-100残留5.3%。经鉴定，该大规模方法制备的DENV-2病毒空壳蛋白电泳检测都无杂蛋白存在，透射电镜检测病毒空壳呈理论大小。同时，本文所建立的大规模病毒空壳制备方法可代替实验室小规模制备方法，同时该方法可应用与其他病毒空壳生产。 6.登革病毒空壳制备的中试工艺设计。本文在解决了制备DENV-2病毒空壳所需大量高纯度病毒、以及在大规模条件下制备病毒空壳的难点后，对DENV-2病毒空壳的制备工艺进行了设计与优化，并以此工艺进行了中试生产。建立了一套生产技术路线，将DENV-2病毒空壳的制备过程量化为细胞培养、生产细胞培养、病毒半成品制备、病毒空壳半成品制备、疫苗成品制备5个过程。经过对工艺进行量化及工序同期化的统筹后，细胞培养环节负责生产用Vero细胞的复苏，每次提供3×107个细胞。生产细胞培养环节刚好用3×107个细胞接种一瓶15L转瓶，并负责制备培养病毒用的单层细胞转瓶。之后病毒半成品环节一次产出500mL蛋白浓度为2mg/mL的登革病毒，刚好用于一次病毒空壳制备。病毒空壳制备环节每次产出蛋白浓度为2mg/mL的病毒空壳100mL。所设计的生产技术路线每个环节都可独立运转，源源不断的向下一环节提供需求。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【图文】：

登革病毒,流行趋势

革病毒疫苗研发面临的困境，理想的登革病毒疫苗应能对四种亚型登革病毒都产生免疫保护能力。在能对抗四种登革病毒的同时，还应具有可以激发长效、平衡免疫保护的能力[9, 10, 13-16]。1.1 登革病毒空壳研究前景1.1.1 登革病毒背景登革病毒以白伊蚊为主要传播媒介，流行于热带和亚热带地区的 100 多个国家之中，是危害较大的一种虫媒病毒[16]。DENV 病毒基因组长 11kb，含有一条单一开放读码框，共编码 3 个结构蛋白(C、prM、E)和 7 个非结构蛋白((NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、 NS5)。登革病毒颗粒呈球形，直径约 45-55nm，病毒颗粒含脂蛋白包膜，并镶嵌有糖蛋白 E 和 M。其中 E 基因编码的 E 蛋白是病毒包膜的主要糖蛋白，分子量约为 51-60kD，含有多种 B 细胞和 T 细胞抗原表位并具有多种生物学功能，如结合靶细胞表面受体、介导膜融合、诱导产生中和抗体、红细胞凝集等，是登革病毒的主要保护性抗原[17, 18]。

示意图,登革病毒,示意图,中和抗体

同时在 DENV 的致病和免疫过程中起着至关重要的作用。结构域 ED III 为 IgG 免疫球蛋白样折叠，具备诱导中和抗体表位及亚型特异性抗原表位，而没有诱导产生非中和抗体与交叉反应抗体的抗原表位。所以以 ED III 作为抗原免疫机体，可以降低 ADE 现象的产生，但同时也缺少了交叉保护能力。因为 E 蛋白是病毒的主要表面蛋白，存在主要的中和位点，因此登革热病毒 E 蛋白作为理想的抗原将很可能成为具备临床应用价值的登革病毒疫苗，目前以各种载体表达获得的 E 蛋白亚单位疫苗尚在研发中[21]。

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