抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体scFV98H的制备及应用研究

发布时间：2020-06-20 12:38

【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患全球性传染疾病，人和动物一旦发病，几乎100%死亡。WHO推荐，对于狂犬病暴露，尤其严重暴露者应全程注射狂犬疫苗与抗狂犬病抗体。抗血清对预防狂犬病起着至关重要作用,由于马免疫血清（ERIG）副反应较大,而人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）来源有限，且存在潜在的病原污染与批次间差异等缺点。因此，急需开发治疗用人源抗狂犬病单克隆抗体或者人源化基因工程抗体。同时无论是狂犬疫苗生产过程中的滴度检测，还是疫苗免疫后的抗狂犬病中和抗体检测都需要相应的检测抗体。经研究证明，由几株能够中和狂犬病毒的人源化单克隆抗体组成的鸡尾酒混合抗体，有可能取代HRIG或ERIG用于狂犬病的暴露后预防。完整单克隆抗体必须在真核系统中进行表达，表达量小，成本高，而基因工程单链抗体可以在原核系统中高效表达。大肠杆菌是目前基因工程药物广泛使用的原核表达系统，表达产物常以包涵体的形式存在。因此，这种表达产物的复性与纯化工艺将成为基因工程下游技术的关键和难点。本论文主要研究了大规模制备抗狂犬病单链抗体scFV98H的发酵、复性和纯化工艺，并探索作为诊断制剂和治疗制剂的可行性。本文主要研究内容和结果如下： 1．检测方法的建立与验证针对蛋白浓度测定方法（BCA法）进行了验证，在8M尿素、3M尿素、0.1M尿素、10%甘油、5%蔗糖体系中对线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限进行了测定，在10%甘油、5%蔗糖体系检测的线性范围变窄，但是在各自的线性范围内，准确性与精密度的CV20%，符合可接受标准。针对测定大肠杆菌宿主DNA的方法（PicoGreen法）进行了验证，在8M尿素体系、3M尿素体系、0.1M尿素体系中对线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限等指标进行了测定；3M尿素体系、0.1M尿素体系中准确性与精密度的CV20%，线性关系良好，符合可接受标准，8M尿素体系的样品需要稀释到3M以下进行检测。建立了狂犬病中和抗体的检测方法——RFFIT法；对该方法进行了验证，测定了RFFIT法的特异性、线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限等指标；在3M尿素体系、0.1M尿素体系、10%甘油体系、5%蔗糖体系中检测结果的CV30%，证明该方法稳定可靠，可以作为复性工艺开发中单链抗体活性分析方法。 2．发酵与包涵体洗涤工艺初步研究本研究鉴定了携带scFv98H基因的工程菌种，进行了大比例传代，连续传10代之后，质粒拷贝数稳定，目的蛋白正确表达，蛋白表达量与原始菌种一致。在摇瓶培养水平，筛选出scFv98H基因的工程菌种的适宜培养基为：完全自诱导培养基或IPTG代替乳糖的不完全自诱导培养基。在3L生物反应器水平，筛选出scFv98H基因的工程菌种适宜的发酵pH范围为：7.0-7.5；适宜的发酵pH调节方式为：25%浓氨水作为pH调节剂。用不含乳糖的不完全自诱导培养基作为基础培养基，以相同的补料方式，采用3L发酵罐与14L发酵罐发酵得到的单位体积的菌体湿生相同。菌体超声后分离包涵体的离心转数和时间为8000rpm、10min，离心两遍；溶液Ⅰ的搅拌洗涤时间为120min；溶液Ⅲ的洗涤后的离心条件为10000rpm、10min。 3．单链抗体scFV98H的纯化复性工艺研究 scFv98H包涵体蛋白在变性条件下，采用IMAC亲和层析、SP、QXL离子交换层析以吸附洗脱模式，能将目的蛋白与大部分杂质分开，纯化效果和稳定性较好。采用DEAE、QXL、Nuvia Q以流穿模式，都能将scFv98H包涵体蛋白与大部分杂质分开，样品处理效率高。采用Nuvia Q的目的蛋白回收率最高，重复性较好。用透析复性的方式筛选出最适pH值，结合实际情况确定为pH9.0。作为诊断制剂的scFv98H蛋白，精细纯化工艺路线为：IMAC亲和层析，QXL吸附洗脱，透析复性。作为治疗制剂的scFv98H蛋白，精细纯化工艺路线为：Nuvia Q流穿纯化，脱盐后，QXL柱上复性。 4．单链抗体scFV98H的诊断应用研究运用诊断制剂纯化复性工艺，制备了scFv98H抗体蛋白，并对复性后单体，二聚体进行了分离，分子量鉴定结果为：scFv98H抗体蛋白单体的分子量30Kda左右，scFv98H抗体蛋白二聚体的分子量60Kda左右。对单链抗体scFv98H的特异性进行了鉴定，能与灭活狂犬病毒特异结合。对单链抗体scFv98H与市售的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体（NP mAb）的结合能力在ELISA和细胞免疫荧光应用进行了比较，在相同蛋白浓度下，二者结合能力相当。测定了scFv98H抗体的亲和力常数Kd为1×106M1。应用scFv98H抗体与NP mAb，对高中低三个水平的ERIG和HRIG的中和抗体效价，和高低水平的MRIG和RRIG中和抗体进行了测定，结果表明，scFv98H抗体与NP mAb的检测值经统计分析没有显著性差异。应用scFv98H抗体与NP mAb，针对不同狂犬病毒株的病毒增殖曲线进行检测，结果表明，scFv98H抗体与NP mAb的检测值经统计分析没有显著性差异。 5．单链抗体scFV98H的治疗应用研究运用治疗制剂纯化复性工艺，制备了scFv98H抗体蛋白，假病毒体系鉴定了scFv98H抗体的中和活性，与HRIG一样能特异地中和假病毒。运用RFFIT法检测scFv98H抗体的中和效价，大于1000IU/mg。检测到scFv98H抗体能与感染狂犬病毒的活细胞表面的糖蛋白结合，而MAbNP不能结合。建立了狂犬病毒暴露后动物模型，用HRIG验证了该模型，为检测scFv98H抗体在动物水平的保护效果奠定了基础。运用建立的狂犬病毒暴露后动物模型，检测scFv98H在狂犬病毒暴露后2小时，20IU/kg的剂量，保护率可达70%，与阳性对照HRIG80%的保护率没有显著性差异。构建了scFv98N的表达菌株，根据scFv98H抗体蛋白制备的工艺路线，制备了scFv98N抗体。对scFv98N抗体的结合活性与中和活性进行测定，其结合活性和中和活性与scFv98H比较没有显著性差异。ScFv98N蛋白37°C放置加速稳定性结果表明，与ERIG的热稳定性一致；药代动力结果表明，体内代谢稳定性低于ERIG。运用建立的狂犬病毒暴露后动物模型检测scFv98N在狂犬病毒暴露后2小时，20IU/kg的剂量，保护率可达70%，与阳性对照HRIG80%的保护率没有显著性差异。总之，以上研究结果表明，本研究建立了单链抗体的制备工艺，采用该工艺生产的scFv98H具有诊断和治疗狂犬病毒感染的应用前景。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392.11

【参考文献】