金黄色葡萄球菌DNA结合蛋白HU生物学功能的初步研究

发布时间：2020-06-21 17:40

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),简称金葡菌(S.aureus),是革兰氏阳性球菌家族的一员,其能够引发皮肤感染、肺炎、心内膜炎和菌血症等多种感染性疾病。已有研究表明生物膜参与了金葡菌在体内的存活以及致病过程。人体内的各种植入物均能成为金葡菌形成生物膜的场所,包括神经外科植入物、心脏支架、中央静脉导管甚至隐形眼镜都能检测到金葡菌形成的生物膜。生物膜通过其自身特殊结构在细菌定植以及感染阶段均为细菌提供了充分的保护,其可以降低宿主抗菌肽的杀细菌作用、抑制吞噬细胞对细菌的吞噬杀伤作用,更为关键的是生物膜对抗生素的抵抗力较强,使抗生素不能有效作用于细菌进而失去抗菌作用。除此之外,生物膜在发育到成熟阶段后会发生解离,生物膜中的细菌能通过人体循环系统扩散至新的感染部位从而引起全身性感染。生物膜(biofilm)是粘附在基质表面的微生物群体构成的复杂结构,其内部的微生物可产生高度水合的胞外聚合物基质(extracellular polymeric substances,EPS)来包裹自身。EPS的主要成分有中胞外蛋白质、胞外DNA和胞外多糖等成分,其中胞外DNA是构成致病菌生物膜的主要结构组分。其胞外蛋白主要有DNABII家族蛋白,包括类组蛋白HU和集合宿主因子蛋白IHF,上述蛋白与DNA具有较高亲和力,且与DNA结合为二聚体形式。DNA结合蛋白家族(DNABII)通过与DNA结合,构成生物膜的网状结构,这在生物膜形成过程中具有重要作用。体内外的研究结果表明,靶向DNABII家族蛋白的抗血清可以破坏生物膜结构,导致已形成的生物膜分解,释放包裹在生物膜内的细菌,在此基础上联合使用抗菌药从而达到治疗目的。噬菌体抗体库技术是指将编码噬菌体P3和P8外壳蛋白的III或VIII基因与抗体的重链和轻链进行基因重组,然后感染大肠杆菌并在大肠杆菌中增殖,最终在噬菌体表面,外壳蛋白与抗体ScFv或Fab片段以融合蛋白的形式展示在细菌表面。噬菌体颗粒能通过感染宿主菌进行扩增并且特异性识别抗原,经“吸附一洗脱一扩增”的循环可大量富集,最终可筛选出针对抗原的特异性抗体。噬菌体抗体库将表型与基因型直接联系起来,从而可将特异性抗体从众多单克隆中高效率地筛选出来。金葡菌HU蛋白是DNABII家族蛋白成员之一,其是以非依赖序列的方式结合胞外DNA,但是HU与金葡菌生物膜形成的相关研究报道较少。因此,本研究通过基因重组表达纯化HU蛋白并制备其特异性抗体等方法,探讨靶向HU蛋白的单克隆和多克隆抗体对金葡菌生物膜形成的影响。研究目的通过基因重组表达纯化HU蛋白并制备其特异性抗体等方法,探讨靶向HU蛋白的单克隆和多克隆抗体对金葡菌生物膜形成的影响。研究方法1)金葡菌HU蛋白的表达情况。通过构建重组表达载体,利用大肠杆菌表达系统重组表达HU蛋白,并通过Ni2+螯合树脂亲和纯化检测HU蛋白的诱导表达情况。2)HU特异性抗体的制备和功能初步研究。利用重组HU蛋白免疫大耳白兔制备其多克隆抗体。同时利用噬菌体抗体库技术筛选抗HU蛋白的全人源单克隆抗体,进一步利用哺乳动物细胞表达体系重组表达和纯化抗体。通过ELISA和Western blot方法检测蛋白HU与其特异性抗体的结合能力。3)HU特异性抗体对金葡菌体外生物膜形成的影响。通过体外生物膜形成实验,利用结晶紫染色和激光共聚焦实验的方法检测HU特异性抗体是否能抑制金葡菌生物膜的形成。并进一步用PIA斑点实验检测了抗体处理后生物膜重要组分PIA的表达水平。4)HU特异性抗体对金葡菌体内生物膜形成的影响。通过构建了导管植入动物模型,利用激光共聚焦显微镜观察金葡菌在植入体内的导管中形成的生物膜。并进一步检测加入HU特异性抗体是否能够抑制小鼠体内植入导管中金葡菌生物膜的形成。研究结果1)成功构建了pET-28a-HU高效表达载体,并且纯化获得了纯度较高的金葡菌重组蛋白HU。2)利用重组HU蛋白免疫大耳白兔制备了抗HU多克隆抗体(anti-HU)。同时,利用噬菌体抗体库技术,经过三轮淘洗筛选获得一个全人源单克隆抗体YG6,利用哺乳动物细胞表达体系重组表达了YG6。ELISA和Western免疫印迹结果表明anti-HU和YG6都能够特异性结合HU。3)Anti-HU以及YG6能够明显抑制体外金葡菌生物膜的形成,且具有一定的浓度依赖性。同时anti-HU以及YG6能抑制PIA的表达。4)建立了生物膜形成动物模型。含绿色荧光GFP质粒的8325菌株成功在小鼠体内植入的导管中形成了生物膜,并可通过激光共聚焦显微镜下观察形成的生物膜形态。同时anti-HU以及YG6抗体都能够抑制小鼠体内植入导管中金葡菌生物膜的形成。结论重组表达了金葡菌HU蛋白,并制备了其相应的多克隆抗体和筛选了其特异性全人源抗体,体内外的研究结果表明抗HU抗体能够抑制金葡菌生物膜的形成。研究结果提示HU蛋白参与了金葡菌生物膜的形成,靶向HU蛋白有可能会阻断金葡菌体内定植和感染。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378
【图文】：

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黄色葡萄球菌 DNA 结合蛋白 HU 生物学功能的初步探究2图1 金葡菌生物膜发育过程模型[4]图注：金葡菌生物膜的发育分为五个阶段：（A）附着，(B)增殖，(C)外流，(D)成熟，（E）分散。A.金葡菌细胞分别通过疏水性相互作用或 MSCRAMM 与非生物或生物表面连接。B.细胞附着后，生物膜发育成由eDNA和蛋白质基质组成的细胞的融合“垫”。C.达到汇合时，发生一段时间的细胞大量出现，其中细胞亚群通过 Sae 调节的核酸酶介导的 eDNA 降解从生物膜释放以允许形成三维微菌落。D.小型菌落形成于在外流阶段保持附着的不同细胞灶。这个阶段的特征是快速的细胞分裂，形成由包括 PSM 和 eDNA在内的蛋白质组成的稳健聚集体。E.活化的 Agr 介导的群体感应通过蛋白酶活化和/或PSM 产生启动生物膜基质调节和细胞分散。AtlA 表示 autolysin A; MSCRAMM 表示microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules; eDNA 表示extracellular DNA;PSM 表示 phenol soluble modulins; Agr 表示 accessory gene regulator.在初始粘附阶段

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而且它能促使细胞在成熟后从生物膜上解离下来，这对体内生物膜具有重要的影响。萄球菌生物膜中，最重要的粘附因子是胞外多糖细胞间粘charide intercellular adhesin，PIA 或 PNAG）[8]。如图 2 所示，PIA，β-1葡糖胺（GlcNAc）残基的均聚物位于金葡菌细胞表面上的纤维链中，与金葡菌生物膜的形成。 PIA 由 ica 基因位点编码，由 icaA、icaB、组成。 IcaA 和 IcaD 形成于细胞膜中的乙酰葡萄糖胺糖基转lcNActransferase）。另一个推定的膜蛋白 IcaC 是形成生物膜所需的较能参与不断增长的 PIA 链的出口。膜表面蛋白 icaB 将分泌到胞外的化。PIA 合成大致分为三步：首先，IcaA 将来自 UDP-GlcNAc 的 G正在延伸的 PIA 链上，IcaA 的活性与 IcaD 密切相关；接着 IcaC 链转运出去；PIA 转运出去后在表面锚定蛋白 IcaB 的作用下发生去正电的残基，PIA 的带电情况与其在细胞表面附着以及生物活性密切

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