BMPR在基质硬度调控脐带间充质干细胞成神经分化中的作用与机制

发布时间：2020-06-23 01:33

【摘要】：基质硬度对细胞的迁移、增殖、分化等多种功能和行为产生重要影响。目前,脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)因其强大的自我更新与多向分化的能力已成为细胞治疗的理想来源。不同基质硬度可诱导间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)呈现不同的分化方向,尤其在软基质MSCs向神经方向分化。但在分化过程中,细胞如何感应基质硬度并将力学信号刺激转化为生物学信号的分子机制尚不明确。本研究通过制备不同硬度的基质,选用UC-MSCs作为研究对象,通过qPCR及Western Blot检测基质硬度诱导UC-MSCs成神经分化过程中骨形态发生蛋白受体(Bone morphogenetic protein receptor,BMPR)发挥的作用及其分子机制。根据课题组前期工作,采用丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合交联制备聚丙烯酰胺水凝胶(Polyacrylamide,PAAM),从而成功获得硬度分别为1-10 kPa、35-38kPa和62-68 kPa的基质。将UC-MSCs培养在不同硬度的基质上,镜下观察到UC-MSCs的细胞形态发生了明显变化。前期研究结果表明,细胞在35-38 kPa的基质上培养,细胞形态呈现为针形,类似于肌细胞;而在62-68 kPa的基质上培养,细胞形态呈现多角形,类似于成骨细胞。而在1-10 kPa的基质上,观察发现细胞形态呈现椭圆形,类似于神经细胞。通过qPCR及Western blot的方法分别检测在三组基质硬度上神经细胞标志物Nestin和βIII tubulin的表达,结果显示,在1-10 kPa的基质上,UC-MSCs高表达神经标志物Nestin和βIII tubulin,表明1-10 kPa基质硬度可诱导UC-MSCs成神经方向分化。为探究在此分化过程BMPR发挥的作用,在三组不同硬度的基质上分别检测UC-MSCs的BMPR的表达水平,结果显示在硬度为1-10 kPa的基质上,UC-MSCs高表达BMPR。在加入BMPR抑制剂(LDN-193189)之后,在1-10kPa的基质上,UC-MSCs神经相关标志物Nestin和βIII tubulin表达量明显降低,由此证明BMPR确实参与了该分化过程。为探究BMPR下游的分子机制,通过Western blot检测BMPR下游相关蛋白Smad及整合素下游相关蛋白AKT、GSK-3β和FAK的表达水平,结果表明,加入BMPR抑制剂后,在1-10 kPa上Smad蛋白磷酸化水平降低,AKT、GSK-3β和FAK的表达水平也明显受到抑制。因此认为BMPR下游可能通过Smad通路发挥作用,并可能与整合素下游发生cross-talk。另外,将钙离子荧光探针装载到UC-MSCs内,发现当加入BMPR抑制剂后,细胞内荧光探针所产生的Ca~(2+)荧光强度也随之降低,因此认为钙离子介导的信号转导可能也参与了UC-MSCs神经分化过程。综上所述,在本研究中,成功制备了不同硬度的基质,并在硬度为1-10 kPa的基质上发现UC-MSCs能够向神经方向分化。BMPR在此分化过程中发挥重要作用,此作用可能是通过调节Smad蛋白,也可能通过与整合素发生cross-talk从而影响分化过程。而钙离子介导的信号途径也可能参与此调控过程,对进一步揭示基质硬度诱导UC-MSCs成神经分化的复杂的分子机制具有重要意义。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

脐带,肉眼观察,冻存,细胞

第 3 章实验结果 hUC-MSCs 的培养与鉴定.1 hUC-MSCs 的原代培养通过组织块培养法从正常足月胎儿的脐带华通胶组织中分离得到大量状的原代 hUC-MSCs。剪碎的组织块在 5-7 天观察可见爬出少量长梭形、的幼稚细胞，细胞呈现单个核，折光性强，细胞边缘清晰。待细胞密度80~90%融合时，可以发现细胞成漩涡状生长，传代时弃去组织块。之后每天传代，传至第 5 代时，观察 hUC-MSCs 已经逐渐纯化，一些混杂细胞，hUC-MSCs 的形态更加均一，为长梭形。将细胞扩增至第 5代冻存备用冻存后复苏，其形态与冻存前并无明显变化。实验所用细胞为状态良好5-7代 hUC-MSCs。如图 3.1所示。

流式细胞术分析,免疫表型,造血细胞标记,细胞

（A）剥离血管后剪碎的华通胶组织。（B）组织块第 5天爬出多角形、长梭形细胞。Scale bar=200 μm（C）P5 代 hUC-MSCs，呈漩涡状。Scalebar=50 μm（D）冻存后复苏 P6 代 hUC-MSCs。Scale bar=200 μm.1.2 hUC-MSCs 的鉴定为验证分离培养的细胞是否具有 MSCs 的特性，接下来对获得的细胞进行定。采用流式细胞术检测发现，hUC-MSCs 不表达造血细胞标记 CD34，CD45，高表达黏附分子 CD44，CD90 以及人间充质干细胞标记 CD105。同时免疫荧检测细胞表面标记物发现，hUC-MSCs阴性表达 CD34，CD45，阳性表达 CD44，D73，CD90，CD105，结果与流式结果相一致。提示获得的 hUC-MSCs 具有间质干细胞的表型特征。

【参考文献】