USP18在登革病毒耐受干扰素中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-25 13:13

【摘要】：研究背景:登革病毒(Dengue virus,DENV)感染可以导致登革热。由于DENV致病机制尚不完全清楚,延缓了治疗方法的开发。目前尚未批准任何特异性抗DENV药物应用于临床,已有的抗其它病毒药物抗DENV的效果不理想。因此寻找新的抗DENV策略是非常必要的。有研究发现,在细胞被DENV感染以前预先用干扰素处理,可以有效抑制DENV感染及病毒在细胞内复制;但是在细胞被DENV感染以后再加入干扰素则不能发挥抗病毒作用,提示DENV感染导致病毒耐受干扰素,但具体的机制尚不清楚。同时有研究显示,在DENV感染的患者外周血单核细胞和DENV感染的体外细胞模型中,泛素特异性蛋白酶18(USP18)的表达水平显著升高。USP18是I型干扰素信号传导通路负调控因子,它通过与干扰素受体亚基(IFNAR2)结合,抑制干扰素诱导的Jak/STAT信号通路的传导。本实验室前期研究发现,在对干扰素治疗不敏感(治疗无效)的丙肝病毒感染者治疗前肝组织内USP18表达水平明显升高;抑制USP18表达显著增强干扰素抗HCV活性,提示USP18在HCV耐受干扰素中发挥非常重要的作用。USP18对DENV复制是否有影响以及与DENV拮抗I型干扰素抗病毒活性(耐受干扰素)是否存在关联,目前尚不清楚。研究目的:1.研究USP18对DENV-2复制的影响及其机制2.研究USP18在DENV-2耐受干扰素中的作用及机制研究内容及方法:1.通过DENV-2感染Hela细胞,干扰素受体缺失的U5A细胞及其母细2fTGH,检测细胞内USP18的表达,明确DENV-2感染诱导USP18的表达是否依赖内源性干扰素的激活;2.通过在Hela细胞中高转USP18或通过siUSP18抑制USP18的表达,再感染DENV-2,检测USP 18对DENV-2复制的影响;3.Hela,2fTGH和U5A细胞转染siUSP18,感染DENV-2后加入IFNα,检测敲低USP18后IFNα对DENV-2复制的影响;4.Hela细胞转染siUSP18,感染DENV-2后加入IFNα,通过Western blot检测Jak/STAT信号通路中信号转导和转录因子(STAT1)的磷酸化水平;通过双荧光报告基因检测干扰素刺激反应原件(ISRE)活性的变化;并通过实时荧光定量PCR对干扰素刺激基因(ISG)的表达水平进行检测;5.构建表达DENV-2病毒蛋白的质粒并在293T细胞中高表达,通过免疫共沉淀法筛选与USP18相互作用的病毒蛋白。研究结果:1.DENV-2感染Hela,2fTGH和U5A细胞后均能诱导USP18表达,提示DENV-2诱导USP18表达不完全依赖干扰素的激活;2.在Hela细胞中高表达USP18促进DENV-2复制,敲低USP18抑制DENV-2复制;3.敲低USP18的Hela和2fTGH细胞感染DENV-2后加入IFNα,IFNα可以抑制DENV-2的复制;4.敲低USP18可以促进STAT1的磷酸化、增强ISRE活性、刺激ISGs的产生;5.USP18与DENV-2的E、NSI和NS3蛋白存在相互作用。研究结论:研究结果表明USP18在DENV-2感染及干扰素耐受中起着重要作用。DENV-2感染诱导USP18的表达,可以不依赖内源性IFN-I介导的Jak/STAT信号通路。高表达USP 18可以促进DENV-2复制,敲低USP 18抑制DENV-2复制。USP 18高表达拮抗IFNα的抗DENV-2活性,导致病毒耐受干扰素;敲低USP18的表达通过激活Jak/STAT信号通路营救IFNα抗DENV-2的活性。同时,USP18与病毒蛋白E、NS1、NS3存在相互作用,USP18可能通过与病毒蛋白相互作用调控病毒复制,具体的机制还需要进一步深入研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：

细胞,细胞病变,感染后,滴度

１．１邋ＤＥＮＶ－２邋的制备逡逑Ｃ６／３６细胞培养在１０邋ｃｍ平皿中，待细胞长到５０％时加入５００邋ｊｘＬＤＥＮＶ－２原液，逡逑每天观察细胞状态，细胞病变效应逐渐显著。如图１所示，待细胞病变达到９０％时，逡逑将培养皿放在－２０°Ｃ和３７。（：冻融一次后，离心收集细胞上清液，ＴＣＩＤ５０法检测己经逡逑扩X椀模模牛危郑驳味取ｅ义希危惧鍉|Ｖ：；＇＇逡逑；邋＇邋＇邋＼邋二、逡逑图１邋ＤＥＮＶ－２感染后细胞病变图逡逑（Ａ）正常Ｃ６／３６细胞；（Ｂ）邋ＤＥＮＶ－２感染５天后Ｃ６／３６细胞逡逑１．２邋ＤＥＮＶ－２滴度的测定逡逑将Ｃ６／３６细胞以１０４个细胞／孔的密度铺在９６孔板中。病毒液用ＲＰＭＩ－１６４０培逡逑养基以１０倍连续稀释的方法从１０－１稀释到ｌ0－１Ｇ，每孔接种１００邋＾Ｌ，设正常细胞为逡逑３９逡逑

细胞,细胞系,时间点,细胞内

将ＤＥＮＶ－２以ＭＯＩ＝ｌ分别感染Ｈｅｌａ细胞、Ｖｅｒｏ细胞、Ｈｕｈ７．０细胞、Ｈｕｈ７．５．１逡逑细胞、２ｆＴＧＨ细胞和Ｕ５Ａ细胞，，在不同的时间点收集细胞，检测细胞内ＤＥＮＶ－２逡逑ＲＮＡ水平。结果如图２所示，ＤＥＮＶ－２成功感染Ｈｅｌａ细胞（图２Ａ），Ｖｅｒｏ细胞（图逡逑２Ｂ），Ｈｕｈ７＿５．１邋细胞（图邋２Ｃ），邋Ｈｕｈ７．０邋细胞（图邋２Ｄ），邋２ｆＴＧＨ邋细胞（图邋２Ｅ）和邋Ｕ５Ａ逡逑细胞（图２Ｆ），并且随着时间的推移，ＤＥＮＶ－２ＲＮＡ逐渐上升，表明ＤＥＮＶ－２能在逡逑这些细胞系中复制增殖。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ＤＥＮＷＩＩｅｌａ逦ＤＦＮＶＡ，ｅｒｏ逡逑１２０００００．０－１邋２００００－逡逑＾邋＝邋．00000．0■逦，逦＊邋Ｉ邋１５０００－逦ｊｌ逡逑Ｉ邋＾邋Ｉ邋？00000．0？逦．１邋＜邋＜邋１００００＇逡逑ｌｉｅ逡逑ｌｉｉ邋８0ｏｔ邋／逦５逦／逡逑ｓｉ邋ｓ／逦ｍＶ逡逑０逦２４逦＜３逦７２逦９６逦０逦１２逦２４逦３６逦４８逦ＳＯ邋７２逡逑ＴｉｎＫ？0Ｓｌ－ｔ，－？ｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋Ｃｈｒｓ）逦Ｔｉｍｅ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｆｈｒ？）逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑ＤＫＮＶ７Ｈ？ｈ７．５．Ｉ逦Ｕ逦讹ＮＶ／Ｉ邋媝逡逑１００００－１逦１０００－，逦，逡逑ｉ邋ｉ邋ｒ：逦ｊ邋ｉ邋￥ｚ逦７逡逑１１１逦［１３邋２

【参考文献】