人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗LOX-1单链抗体的筛选

发布时间：2020-06-27 06:37

【摘要】：凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)是氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的主要受体,分子量约为50 kDa的II型膜蛋白,属于C型凝集素家族。LOX-1胞外结构域(LOX-1 extracellular domain,LOX-1 ECD)被蛋白酶水解并释放到血液中形成可溶性LOX-1(soluble LOX-1,sLOX-1)。LOX-1是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)及As相关疾病的新型潜在药物靶点。此外,通过LOX-1的靶向成像可实现动脉硬化斑块的定位和危险分层。因此,以LOX-1为靶点的抗体研发对于动脉硬化治疗具有重要意义。尤其是人源抗体在临床诊断和治疗中更加安全、有效,是抗体研究的热点。然而,目前所报道的LOX-1抗体多为动物来源,人源抗体的研究报道极少。噬菌体展示技术避免了杂交瘤技术所必需的动物免疫过程,是体外获得人源抗体的重要手段。它的最大优势是可直接将抗体片段展示于噬菌体表面并与内部包裹的基因信息建立物理连接,便于操作。不同于完整免疫球蛋白分子,单链抗体(single chain variable fragment,scFv)是由重链可变区VH和轻链可变区VL经由一段氨基酸肽段(Linker)连接而成的基因工程小分子抗体。scFv分子量小,免疫原性小,且在组织和肿瘤的渗透性强,在动脉硬化斑块的成像、治疗上具有相当的优势。本文为获得抗LOX-1全人源scFv,构建了库容量为6.2×108的人源scFv噬菌体展示文库,并从中筛选获得了一株亲和常数为5.8×10-6 M的单链抗体scFv-39,本研究为以LOX-1人源抗体为核心的治疗动脉粥样硬化药物的研发奠定了基础。首先,本研究采用大肠杆菌原核表达系统成功地实现了 LOX-1 ECD蛋白的大量可溶性表达,并采用MBP亲和层析和分子筛纯化方法获得了纯化的LOX-1 ECD。通过对宿主细胞和促溶标签的系统性优化,结果表明在宿主细胞Rosetta gami2(DE3)中,LOX-1 ECD与MBP标签融合表达时,融合蛋白的可溶性表达产量最高。通过表达条件优化后发现,MBP-LOX-1 ECD融合蛋白在30℃条件下培养,采用200 μM的IPTG诱导,蛋白的可溶性表达产量最高。本文通过MBP亲和层析和分子筛的纯化,获得了纯化的融合蛋白MBP-LOX-IECD。采用浓度为2.5 U/mg的凝血酶作用于MBP和LOX-1 ECD蛋白之间的氨基酸识别位点,有效地去除融合蛋白中的MBP标签。再通过MBP亲和层析和分子筛结合的纯化方法获得了纯度为95%的LOX-1 ECD蛋白,并具有较高的oxLDL结合活性。其次,采用分子生物学和基因工程的方法构建了一个容量为6.2×108人源scFv噬菌体展示文库。本文分离20名心血管病人PBMC(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),提取总RNA并反转录为cDNA。采用半巢式PCR方法扩增重链可变区VH和轻链可变区Vλ/Vκ基因片段,并通过重叠延伸PCR方法分别将VH和Vλ/κ拼接为scFv。采用基因工程方法连接scFv至噬菌体展示系统的噬菌粒载体,并将重组载体电转化进入TG1细胞,构建了人源scFv噬菌体展示系统,并对文库的阳性率和多样性进行了鉴定。然后本实验以LOX-1 ECD为抗原,从自构建的人源scFv噬菌体展示文库中筛选阳性重组噬菌体。采用固相淘筛方法,首先以免疫管为固相基质,进行了3轮淘筛,并采用噬菌斑计数方法鉴定每轮淘筛的文库输入量和输出量。同时采用多克隆噬菌体ELISA方法鉴定噬菌体与抗原特异性结合信号值的变化。结果表明,通过3轮淘筛,文库中抗LOX-1ECD特异性重组噬菌体得到了有效富集。采用单克隆噬菌体ELISA方法,从富集后的噬菌体中随机挑选了 40个单克隆进行阳性克隆的筛选并获得了 10株阳性克隆。最后本研究采用生物信息学方法对阳性克隆scFv-39序列进行了分析,并对其进行克隆和可溶性表达及亲和力活性测定。通过IMGT数据库工具对scFv-39序列进行分析,确定scFv序列具有人源VH和VL区序列的基因特征,并确定了 CDRs区域。此外,分别采用ExPAsy数据库的SOPMA工具、GENETYX软件对scFv-39的二级结构特征、物理性质进行预测。scFv-39共有735个碱基,编码245个氨基酸序列。scFv-39平均分子量大小为26209.7 Da,等电点为8.98。采用短小芽孢杆菌表达系统实现了 scFv-39的可溶性分泌表达,并在scFv-39的C-端引入6×His标签,采用镍柱亲和层析和分子筛结合的方法获得了纯化的scFv-39。采用间接ELISA方法测定scFv-39的亲和常数为5.8×10-6M。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

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本文编号：2731454