天然产物抗单纯疱疹病毒感染活性评价及机理研究

发布时间：2020-06-28 01:47

【摘要】：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是引起人类皮肤性疾病的常见病原体。人类是HSV感染的唯一宿主。HSV主要感染人类面部以及生殖器部位的皮肤和黏膜,能引起口唇疱疹、口腔黏膜炎、角膜炎、生殖器疱疹甚至疱疹性脑炎等。另外,研究证实HSV感染与流产、早产、畸胎、死胎、新生儿感染以及宫颈癌、阿尔茨海默等多种疾病密切相关。HSV是一种具有囊膜结构的线性双链DNA病毒。根据血清型不同,HSV可分为Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。据统计,成人HSV-1血清抗体阳性率高达90%。另外,HSV-2感染导致的生殖器疱疹不仅是一种性传播疾病(sexually transmitted disease, STD),并且其感染还能显著增加艾滋病病原体HIV (human immunodeficiency virus)的传播。HSV具有裂解性感染和潜伏感染两种方式。当裂解性感染症状消退后,部分病毒沿轴突上行至神经节并建立潜伏感染,并能逃避宿主免疫系统的监测。当机体免疫功能低下或受到外界压力时,潜伏感染的病毒被激活导致复发。目前没有可用于防治HSV的疫苗,临床治疗HSV感染的药物主要为核苷类似物,包括阿昔洛韦及其衍生物泛昔洛韦等。虽然这些核苷类似物能特异性阻断病毒DNA复制过程,但是也存在很多缺陷,例如靶点单一,生物利用度低,半衰期短以及严重的副反应等。另外,这些药物不能防止病毒的潜伏感染和复发频率,对于突变株病毒的感染,这些核苷类似物将会完全失效。因此寻找作用广泛、毒副作用小的抗HSV药物十分重要。天然产物来源广泛,并且具有简便易得、低毒等特点。因此,天然产物是寻找抗病毒活性成分的重要资源。目前,对于天然产物特别是植物提取物抗病毒的研究很多,但是大多停留在简单筛选水平。本研究旨从天然产物包括中草药以及植物代谢产物中筛选具有抑制HSV感染的候选药物,并进一步寻找抗病毒活性化合物,研究抗病毒感染作用机理,为有效开发利用天然产物作为抗病毒先导化合物和抗病毒药物提供基础。我们从中国传统中草药中筛选到药食两用的鱼腥草植物水提物(water extract of Houttuynia cordata, HCWE)具有显著抗HSV感染作用,其半数抑制浓度(the half maximal inhibitory concentration, IC50)为50μg/ml。NF-κB (nuclear factor-κB)作为HSV病毒复制过程中所需的转录因子,抑制其转录活化,能够抑制病毒的感染。通过核浆蛋白分离实验我们发现,HSV-2感染6小时开始明显诱导细胞转录因子NF-κB活化进核,HCWE处理组能显著抑制病毒感染诱导的NF-κB的活化。免疫荧光、免疫印迹以及PFU (plaque forming unit)实验结果显示,HCWE特异性抑制病毒感染过程中NF-κB的活化,而不影响病毒感染诱导的MAPKs (mitogen-activated protein kinase)通路的活化,从而降低感染性病毒颗粒的产生和病毒蛋白的表达。通过HPLC (high performance liquid chromatography)化学分析,我们进一步鉴定出水提物中的主要黄酮类化合物槲皮素、槲皮苷以及异槲皮苷可能为抑制HSV感染的有效活性成分。另外,多酚类化合物白藜芦醇和其寡聚体广泛分布于植物中,是植物的次级代谢产物,具有广泛的生物功能。我们筛选了32种从植物中分离鉴定出的白藜芦醇衍生物的抗病毒活性,并发现10种白藜芦醇寡聚体具有显著抑制HSV-1和HSV-2感染作用。其抑制HSV-2的IC50均低于5μM。利用流式细胞术方法,我们检测到白藜芦醇寡聚体能显著性地短暂诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生。通过添加活性氧的清除剂NAC (N-acetylcysteine)能有效逆转化合物的抗病毒感染作用。这些结果说明,化合物能够通过诱导产生ROS,从而抑制HSV的感染。这也预示着ROS可能作为信号分子在抗病毒感染过程中发挥积极作用。但是化合物通过何种途径诱导ROS的产生以及ROS在抗病毒感染过程中的具体作用还需要进一步研究。综上所述,我们的工作将为天然产物抗HSV感染以及靶点研究提供新的思路,为开发利用天然产物作为抗病毒前体药物提供实验基础。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.11
【图文】：

阿昔洛韦,阳性对照,预处理,病毒感染

图1.1. HCWE抑制HSV-2的感染Vero细胞用不同浓度的HCWE (45, 150, 450 ng/ml)预处理2h，同时用5 tiM的阿昔洛韦（ACV)处理相同时间作为阳性对照。细胞感染HSV-2 (M0I = 2) 48h后用MTT方法检测细胞活力，测得的OD570值与未处理的对照组（Con)进行标准化后，得到不同处理组细胞相对活力，用以反映病毒感染情况（A)。在平行实验中，收集不同处理组的细胞感染上清和细胞，用PFU方法检测病毒感染性颗粒的产生。通过各组数据与未处理的感染组（HSV-2)数据统计分析后，得到P值，其中*P<0.05, **P<0.01表示具有显著性差异（B)。在时间点给药实验中，用450 ng/ml浓度的HCWE在HSV-2感染之前2 h (-2h),感染的同时（Oh)或者感染后2 h、6 h、12 h处理Vero细胞，在病毒感染48 h后，用MTT方法检测细胞活力，并根据公式计算HCWE在不同时间处理对HSV-2感染的抑制率（C)。Fig. 1.1. Inhibition of HSV-2 infection by Houttuynia cordata water extract. Dose responseof HCWE on HSV-2 infection. (A) Monolayers of Vero cells in 96-well plates were infectedwith HSV-2 at an MOI of 2 in the presence or absence of HCWE at 45，150，450 ng/ml.HSV-2 infection caused cytolytic effect. At 48 h post-infection (PI), cells that remained15

姜黄素,刺激细胞,内参,免疫印迹

出[3细胞用450^18/1111的日%￡处理211后，感染 HSV-2 (M0I = 5) 6h、12 h、24 h后，收集细胞进行核蛋白提取，并用免疫印迹检测p65蛋白的进核情况，Lamin B作为核蛋白的内参，条带相对灰度值是用软件测得条带的灰度值后与未处理的对照组进行比较获得（A)。HeLa细胞用450阳/ml的HCWE处理2h后，感染HSV-2 (MOI =5)12h后，用免疫焚光观察p65蛋白的胞内定位情况，同时用TNFa刺激细胞30 min以诱导p65进核作为阳性对照（B)。Vero细胞用lOgM姜黄素（Cur)或450 ^xg/ml的HCWE预处理2 h，感染病毒24 h后获取细胞总蛋白，用免疫印迹检测HSV-2蛋白ICPO的表达情况以及NF-kB抑制蛋白IkBcx的降解情况（C)。另外，10|iM姜黄素（Cur)或450 pg/ml的HCWE预处理HeLa细胞2h后，用1 ng/ml的TNFa刺激细胞30 min，获取细胞总蛋白检测细胞中IicBa蛋白的降解情况（D)，GAPDH作为内参对照。Fig. 1.2. HSV-2 infection induces NF-kB activation and HCWE treatment blocks NF-kBactivation. HeLa cells were infected with HSV-2 (MOI = 5) in the presence or absence of 450^ig/ml HCWE for 6, 12 and 24 h. NF-KB/p65 nuclear translocation was determined by proteinfractionation followed by immunoblotting with anti-p65 antibody. HSV-2 infection inducedpersistent NF-KB/p65 protein nuclear translocation, while treatment with HCWE blockedNF-KB/p65 activation induced by HSV-2 infection (A). The numbers represent relativeintensity of a p65 protein band to Lamin B, a loading control, in each sample compared tountreated and uninfected control. (B) Immunofluorescence assay also showed that HCWE

【共引文献】