Vero细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用

发布时间：2017-03-29 00:10

  本文关键词：Vero细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流行性感冒是人类至今不能有效控制的传染病之一,每次流行都给人类的健康和经济造成重大的损失。虽然有抗病毒药物,但可能诱导耐药株出现,不适合大范围长时间来应对流行性感冒。目前接种疫苗仍被认为是预防流感的最好方法。传统的流感疫苗以鸡胚为培养基质,生产过程容易受到微生物的污染、不能大规模生产、对流感大流行应急能力差等,因此基于动物细胞为基质生产的流感疫苗成为疫苗发展的重要方向。非洲绿猴肾细胞系Vero是世界卫生组织WHO推荐的人用疫苗生产基质,目前已用于多种疫苗的生产,其安全性已得到认证。在流感大流行时,如何提高细胞培养技术水平以提高流感疫苗的产量和生产效率及病毒的培养条件成为动物细胞大规模培养及疫苗生产的目标和竞争核心。动物细胞无血清培养基的开发,将实现流感疫苗高效率、低成本的生产,成为流感疫苗开发的重要环节。因此,本文借助统计学方法开发适用于Vero细胞生长的无血清培养基。首先,本文通过连续运用单因素实验—Plackett-Burman实验—最陡爬坡实验—中心组合实验5种统计学方法,建立了Vero细胞无血清培养基快速高效的开发技术。通过单因素实验设计确定了胰岛素、转铁蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生长因子、透明质酸和亚硒酸钠在后续实验中的添加浓度,考察的浓度范围分别为胰岛素3-6ug/mL,转铁蛋白7.5-15ug/mL、高密度脂蛋白10-2Oug/mL、牛血清白蛋白2-4mg/mL、表皮生长因子50-100ng/mL、透明质酸15-30mg/mL、亚硒酸钠4-8mmol/mL;进一步通过Plackett-Burman实验考察胰岛素、转铁蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生长因子、透明质酸和亚硒酸钠7种添加物对Vero细胞生长的影响作用大小,方差分析结果表明胰岛素、牛血清白蛋白对Vero细胞的生长有显著正影响作用(p0.05),转铁蛋白、表皮生长因子、透明质酸有正影响作用(p0.05),而高密度脂蛋白和亚硒酸钠对细胞生长存在负影响作用；又通过最陡爬坡实验拓宽胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白的浓度范围,3种添加物的浓度分别为5.4ug/mL,13.8ug/mL,3.6mg/mL时,测定的OD490值最大；最后通过中心组合实验确定胰岛素、转铁蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度条件,分别为胰岛素5.625ug/mL,转铁蛋白14.034ug/mL,牛血清白蛋白3.92mg/mL,按此条件配制的无血清培养基可支持Vero细胞的连续培养。随后,利用Vero细胞无血清培养培养体系,对Vero细胞培养H5N1流感病毒过程的MOI及TPCK-胰蛋白酶的添加量进行优化,自配无血清培养体系培养H5N1流感病毒的条件为：接种量MOI为0.001,TPCK-胰蛋白酶的添加量1ug/mL,并且每隔24h补加初始浓度的TPCK-胰蛋白酶。在优化的H5N1流感病毒生产条件下,自配无血清培养基和Gibco商品化无血清培养基培养H5N1流感病毒的的HA及感染性滴度没有显著性差别,但都低于完全培养基培养。完全培养基、自配无血清培养基和Gibco商品化无血清培养基三种培养基培养出的病毒HA滴度分别为：512HAU/50uL、277.3HAU/50uL、149.3HAU/50uL,感染性滴度分别为：108.375±0.25TCID50/mL、107.75±0.06TCID5o/mL 和 107.32±0.12TCID50/mL。表明自配无血清培养基培养体系适于流感病毒疫苗的生产,但和完全培养基培养体系相比仍有一定的差别。目前,仍不能应用于规模化流感疫苗的生产,需继续对此无血清培养基的配方继续进行优化。
【关键词】：Vero细胞 无血清培养基 统计学方法 H5N1流感病毒
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.13
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-17
• 第一部分 Vero细胞无血清培养基的研制17-48
• 1. 实验材料17-18
• 1.1 细胞株17
• 1.2 细胞培养基17
• 1.3 细胞培养基添加成分17
• 1.4 实验试剂17-18
• 1.5 主要仪器设备18
• 2. 实验方法18-27
• 2.1 种子细胞复苏18-19
• 2.2 细胞传代19
• 2.3 细胞无血清饥饿19
• 2.4 无血清培养基的优化19-20
• 2.5 无血清细胞冻存20
• 2.6 分析方法20-22
• 2.6.1 细胞形态学观察20
• 2.6.2 细胞计数20-21
• 2.6.3 长期稳定性实验21
• 2.6.4 细胞生长曲线绘制21
• 2.6.5 CCK-8法测定细胞增值21-22
• 2.7 统计学分析22
• 2.8 无血清培养基优化设计22-26
• 2.8.1 单因素实验23
• 2.8.2 Plackett-Burman实验设计23-25
• 2.8.3 最陡爬坡实验25
• 2.8.4 中心组合实验25-26
• 2.9 优化组合验证26-27
• 3. 结果和分析27-38
• 3.1 单因素实验27-29
• 3.2 Plackett-Burman实验结果29-30
• 3.3 最陡爬坡实验结果30-32
• 3.4 中心组合实验结果32-35
• 3.5 优化组合的验证35
• 3.6 长期稳定性实验35-37
• 3.7 细胞生长曲线测定37-38
• 讨论38-40
• 小结40-41
• 参考文献41-48
• 第二部分 Vero细胞无血清培养基培养H5N1流感病毒48-63
• 1. 实验材料48-49
• 1.1 病毒株48
• 1.2 细胞株48
• 1.3 主要仪器设备48-49
• 1.4 实验试剂49
• 2. 实验方法49-51
• 2.1 流感病毒A/Anhui/1/2005 Va(H5N1)的扩增49-50
• 2.2 流感病毒A/Anhui/1/2005 Va(H5N1)的收获50
• 2.3 MOI的计算50
• 2.4 病毒测定50-51
• 2.4.1 感染性滴度测定(TCID50)50-51
• 2.4.2 病毒血凝值(HA)测定51
• 2.5 统计学分析51
• 3. 结果与分析51-59
• 3.1 流感病毒感染SFM-Vero20细胞的条件优化51-56
• 3.1.1 TPCK-胰蛋白酶添加量的优化51-53
• 3.1.2 补加TPCK-胰蛋白酶的影响53-54
• 3.1.3 MOI的优化54-56
• 3.2 三种培养基中Vero细胞生产病毒情况对比56-59
• 讨论59-61
• 小结61-62
• 参考文献62-63
• 附录Ⅰ缩略词表63-64
• 附录Ⅱ 主要溶液及培养基配置64-70
• 致谢70-71
• 个人简历71-73

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 冯婷;涂文伟;黄娟;李晋蓉;殷仲伟;范营营;李虹;;流感病毒H1N1在MDCK细胞的培养及纯化条件的优化[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年

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本文编号：273305