QKI5及其结合的lnc6在精子发生中的功能与机制研究

发布时间：2020-07-03 14:43

【摘要】：长非编码RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)类型众多,且作用方式复杂多样,可以与DNA、RNA和蛋白等结合发挥“支架”、“引导”、“海绵”等等作用,对基因表达的调控具有很高的精密性。精子发生(Spermatogenesis)是极其复杂而特异的细胞分化过程,相较于体细胞的分化,历经了许多重要的特殊事件,这些事件都在精密的调控下进行。因此,lncRNA在精子发生中很有可能也扮演着重要调控者的角色。但是,至今lncRNA在精子发生中的功能与机制研究还比较少。所以,深入研究lncRNA在精子发生过程中的功能与机制,对解决男性不育这世界性医学难题将具有重要意义。有研究表示RNA结合蛋白QKI可以和相应lncRNA结合发挥功能,在神经发育、血管发育和肿瘤发生等领域,具有调控细胞的增殖、分化、迁移等作用。本实验室前期研究发现QKI5在睾丸组织中表达水平相对较高,尤其在4 w和5 w的睾丸组织中,主要在粗线期精母细胞表达水平最高;在细胞系上发现QKI5在GCl-spg中表达水平较高,主要定位于细胞核,部分位于细胞质中。RIP-seq和生信分析发现,在MAPK信号通路上高富集,而此信号通路大多与细胞凋亡、增殖和分化相关。本研究在此基础上,着重开展QKI5在精子发生中的功能。我们首先探索了 QKI5在细胞凋亡中的作用。利用siRNA抑制GCl-spg细胞中内源QKI5蛋白的表达,分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h加入Etoposide诱导细胞凋亡,采用流式细胞仪检测GCl-spg细胞凋亡的比例变化。实验结果发现,随着Etoposide诱导时间增长,对照组和实验组的凋亡比例都在增加,但是实验组的细胞凋亡比例明显低于对照组。表明抑制QKI5的表达水平可以抑制GCl-spg细胞的凋亡,即QKI5在生精细胞中对细胞凋亡有促进作用。实验还发现si-QKI5实验组的cleaved caspase3表达量变化明显,且作为caspase3凋亡前期的p38-MAPK信号通路中p-p38、p38等关键分子及其信号通路上游PARP蛋白的表达水平与对照组形成明显差异。表明在生精细胞中QKI5是通过活化p38-MAPK信号通路来促进细胞凋亡。前期通过RIP、RNA-pulldown和生信分析,最终筛选出QKI5结合的13条候选lncRNA。其中lnc6和lnc11有组织特异性,与QKI5的变化趋势大体一致,并将目标最后指向lnc6。本研究中采用RNA-pulldown进行反向验证,结果显示反义链探针可以同时检出lnc6和QKI5,表明lnc6与QK5相互结合,确认了 lnc6为QKI5结合的长链非编码RNA。随即开展了对lnc6的功能认识。在不同组织、六种不同时期生精细胞、不同发育时期的睾丸组织、四种不同生殖细胞系和细胞定位等检测了 lnc6的表达量,发现lnc6在睾丸组织中表达量相对较高,尤其前期生精细胞表达量最高,定位在细胞核。我们用siRNA抑制GCl-spg细胞内源lnc6的表达,再加入Etoposide处理细胞诱导细胞凋亡,检测GCl-spg细胞凋亡的比例变化。实验结果发现,随着Etoposide诱导时间增长,对照组和实验组的凋亡比例都在增加,但是实验组的细胞凋亡比例明显高于对照组,表明了抑制lnc6的表达可以促进GCl-spg细胞的凋亡;实验组的PARP蛋白、p-p38蛋白、p38蛋白的表达水平也随之发生了相应变化。结果显示在生精细胞中lnc6是可以抑制GCl-spg细胞的凋亡,是通过抑制p38-MAPK信号通路来实现的,这与QKI5的作用正好拮抗。进而探索QKI5和lnc6是如何调控细胞凋亡的?我们发现当抑制lnc6时,p38-MAPK信号通路中的mapk11、mapk12和mapk14的RNA稳定性增高;而当抑制QKI5表达时,lnc6的表达量相比对照组有微弱上升趋势;当过表达外源性lnc6,发现cleaved caspase3、p-p38、p38和PARP等蛋白的表达量低于对照组;而同时抑制lnc6和QKI5时,也发现si-lnc6/QKI5实验组的表达量介于si-lnc6、si-QKI5组之间,与NC对照组有大致相同趋势。这些实验结果也验证了以下推测:正常情况下,QKI5可以维持p38-MAPK的mRNA和lnc6的稳定性;当QKI5缺失时,p38-MAPK的mRNA不能被QKI5稳定,故而不能正常翻译,从而使得cleavedcaspase3表达被抑制,细胞凋亡过程被抑制;当lnc6被抑制时,QKI5与lnc6结合位点被大量释放,QKI5与p38-MAPK的结合位点增多,从而使得p38-MAPK的mRNA被QKI5稳定,使得cleaved caspase3表达被激活,从而促进细胞凋亡。p38-MAPK的mRNA与lnc6可能通过竞争性结合QKI5的结合位点从而调控细胞凋亡。综上,我们在体外研究了 QKI5及其结合的lnc6在精子发生中的功能和机制:发现QKI5可以通过活化p38-MAPK信号通路来促进细胞凋亡;同时确认了 lnc6可与QKI5结合,其可以通过抑制p38-MAPK信号通路来抑制细胞凋亡;QKI5与lnc6的作用机制可能是通过竞争调节模式来调控细胞凋亡。在研究QKI5对细胞凋亡影响的同时,我们还利用CRISPR/CAS9技术构建了 qki基因敲除的GCl-spg细胞株,通过筛选和鉴定,获得1#靶点单细胞株3株,2#靶点单细胞株3株,最终选择GTCCGAG的碱基缺失突变体1#06作为研究细胞增殖和分化实验的材料。结果发现cas-QKI5实验组细胞增殖明显慢于对照组的细胞增殖趋势(*P0.05);检测减数分裂相关分子标志物c-kit、Mtl5和Hspa2的表达水平,发现实验组显著低于对照组。这表明QKI5也具有促进细胞增殖和细胞分化的功能。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R321.1
【图文】：

序列,反义链,正义,检出

ｌｎｃ６是否确实为ＱＫＩ５结合的长链非编码ＲＮＡ？我们采用ＲＮＡ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ进行了逡逑反向验证。根据ｌｎｃ６设计了正义和反义链探针（靶点序列见表８），结果可见反义链探逡逑针可以检出ｌｎｃ６邋（图３Ａ）和ＱＫＩ５邋（图３Ｂ），表明ｌｎｃ６与ＱＫ５相结合。逡逑据此，我们最终确定以ｌｎｃ６为对象，研究ＱＫＩ５与ｌｎｃ６的相互作用和功能。逡逑１００－，逡逑§９０－逡逑＇Ｚ邋ｓｏ－逡逑７。．邋■！逡逑ｅ叨＿邋ｍ逡逑ａ逦Ｉｎｐｕｔ邋ＡＳ邋ＳＳ逡逑！邋逦逡逑！逦■逦ＱＫＩ５邋＿逡逑＾邋孑邋／邋Ｔｕｂｕｌｉｎ邋？？逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图３邋ｌｎｃ６与ＱＫＩ５相互作用的检测逡逑Ａ：根据ｌｎｃ６设计的正义链和反义链探针ｐｕｌｌｄｏｗｎ检出的相应三组ｌｎｃ６的相对含逡逑量；Ｂ：三组ｐｕｌｌｄｏｗｎ检出的ＱＫＩ５蛋白的相对含量。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｎｃ６邋ａｎｄ邋ＱＫＩ５逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ邋ｔｌｉｒｅｅ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｌｎｃ６邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ逡逑ｐｕｌｌｄｏｗｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｅｎｓｅ邋ａｎｄ邋ａｎｔｉｓｅｎｓｅ邋ｓｔｒａｎｄ邋ｐｒ

表达谱,生精细胞,精原细胞,精子

３．１邋ｌｎｃ６的基本信息逡逑我们检测了邋ｌｎｃ６的组织表达谱，在脑、心、肾、肝、肺、肌肉、脾和睾丸等组织逡逑中的表达情况，发现ｌｎｃ６在睾丸组织中表达量相对较高（图４Ａ）；我们分离了睾丸中逡逑的生精细胞、间质细胞和支持细胞，检测发现ｌｎｃ６在生精细胞中表达量最高（图４Ｂ）；逡逑进一步我们检测了不同发育阶段生精细胞中的表达情况，通过重力沉降法分离得到Ａ逡逑型精原细胞、Ｂ型精原细胞、前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子和长型逡逑精子六种不同时期生精细胞，发现ｌｎｃ６在前期表达量相对较高；在不同发育时期的睾逡逑丸组织中，发现ｌｎｃ６在１０邋ｄ和１４邋ｄ的睾丸组织中表达量最高（图４Ｃ）：此外，我们还逡逑对wj丸组织中的四株细胞系进行检测，其中两株为生精细胞ＧＣｌ－ｓｐｇ、ＧＣ２－ｓｐｇ，两株逡逑为Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞ＴＭ３、ＴＭ４，结果也发现ｌｎｃ６在ＧＣｌ－ｓｐｇ细胞中表达量最高（图４Ｄ）。逡逑＝１0１邋§５１逡逑！：邋｜逦１｜逡逑Ｉ邋？福逡逑ｉｊ＿邋＿邋＿逡逑／／／＂／／／邋／邋／邋／逡逑Ａ逦Ｂ逡逑１．５－１逦０．２５－逡逑１逦ｌａ逦ｆ：ｉ逡逑ｉ邋ｋＵＵｌｌ逡逑々邋＞邋汐＃邋＃邋＃邋＃逦＃邋00ａ邋参邋＾逡逑

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