WDR5在间充质干细胞中的功能调控作用及机制研究

发布时间：2020-07-03 15:26

【摘要】：目的:间充质干细胞是一类能够自我复制,克隆形成和多谱系分化的多能干细胞,正是其多向的分化功能,使其在多方面有着应用前景。WDR5作为WD40蛋白家族的主要成员,在组织再生和骨组织发育中存在重要的作用,然而其在间充质干细胞中的作用尚不明确。因此阐明WDR5是否为调控间充质干细胞的关键靶点,为研发促进牙再生、骨再生的小分子制剂提供理论依据。方法:1.获得人间充质干细胞2.目的质粒的获取将WDR5的基因序列在NCBI数据库查询获得,应用Whitehead提供的程序设计WDR5的SiRNA,将其插入慢病毒的shRNA载体pLKO.1上,测序鉴定,最终构建成WDR5 shRNA质粒。采用基因合成的方法得到加表面标签Myc Tag的WDR5基因全长,将其连接到逆转录病毒pQCXIN的表达载体上,对序列进行鉴定后,最终构建成WDR5的Myc-WDR5过表达质粒。3.包装以及收集病毒对照组Scramble shRNA(Scramsh)空载体质粒、实验组WDR5 shRNA(WDR5sh)质粒及对应的包装质粒(VSVG和dv-8.2)培养于293T细胞中进行病毒的包装,48小时后将获取的上清液行病毒滴度测定,平均分装于冻存管中,-80℃冰箱留存。逆转录病毒对照空质粒pQCXIN、实验组Myc-WDR5的质粒及相应的包装质粒(CPI和GPE)培养于293T细胞中进行病毒的包装,72小时后将获取的上清液行病毒滴度测定,平均分装于冻存管中,-80℃冰箱留存。4.构建稳定转染的细胞系利用Scramsh以及WDR5sh病毒,分别对间充质干细胞进行转染,48小时后对转染后的细胞加入puromycin进行筛选,筛选3天后得到对照Scramsh和WDR5sh病毒稳定转染的间充质干细胞。为确定病毒的转染效率,对转染后的细胞进行mRNA层面以及蛋白表达层面对间充质干细胞WDR5的敲低效果进行检测。对照组病毒pQCXIN和实验组病毒Myc-WDR5转染细胞,转染后48小时后对转染病毒的细胞行7天G418的筛选,为确定病毒的转染效率,对转染后的细胞进行mRNA层面以及蛋白表达层面对间充质干细胞WDR5的过表达效果进行检测。5.WDR5对间充质干细胞功能影响的体外研究成骨/成牙本质分化能力的检测:用成骨/成牙本质诱导的培养液(Millipore)对间充质干细胞在体外向成骨/成牙本质的方向分化诱导。其中包括细胞在成骨诱导初期指标-碱性磷酸酶活性,晚期分化指标(细胞体外矿化能力)-茜素红和钙离子浓度检测。同时收取诱导过程中细胞并提取mRNA进行检测,其中包括成骨/成牙分化指标(RUNX2、DSPP、OPN、BSP、DMP-1)在1周、2周、3周表达的变化。成神经向分化能力检测:对间充质干细胞在体外进行成神经方向分化诱导。其中包括收取成神经方向诱导过程中的细胞,提取mRNA后检测成神经分化指标(NCAM、TH、βIII-Tubulin、NerouD)在3天、6天、9天表达量的变化。并观察细胞诱导后形态学变化及免疫荧光鉴定神经干细胞标记物Nestin和早期神经元标记物β-III-Tubulin。成血管向分化检测:对间充质干细胞进行成血管方向分化诱导。在诱导0天、4天、7天、10天时间点收取细胞提取mRNA,检测RNA各个时期成血管分化指标(ANG-1、VEGF、PDGFA)等的变化。6.统计学分析应用统计学计算软件SPSS 22.2,根据t检验或方差分析,实验结果P值小于0.05表示有统计学差异。结果:1.对稳定转染WDR5的根尖牙乳头干细胞,在mRNA和蛋白表达量上进行测定,结果表明转染后的根尖牙乳头干细胞WDR5基因敲低组与WDR5基因过表达组均存在明显敲低效果与过表达效果。2.通过检测5天的ALP活性、3周的ARS染色、以及钙离子浓度测定和经过1周、2周、3周成骨诱导的细胞mRNA,结果表明和对照组相比,敲低WDR5的根尖牙乳头干细胞中ALP活性、ARS染色、钙离子浓度明显增高,成神经向分化指标(NCAM、TH、β-III-Tubulin、NerouD),在骨髓间充质干细胞中具有相同结果。成血管向分化指标(ANG-1、VEGF、PDGFA),同样也表达升高,过表达组结果则与之相反。根尖牙乳头干细胞中过表达WDR5组与对照组相比,成骨/成牙相关分化指标(RUNX2、OPN、BSP、DSPP、DMP1)表达降低。结论:1.WDR5体外抑制间充质干细胞早期成骨/成牙指标-ALP活性、体外矿化能力、晚期成骨/成牙分化指标及关键转录因子的表达。2.WDR5体外抑制间充质干细胞神经向分化的形态学改变、神经向特异性蛋白表达以及神经向分化指标的表达。3.WDR5体外抑制SCAPs成血管向分化指标的表达。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

内参,过表达,效果检测,实验结果

图 1 WDR5 敲低效果以及过表达效果检测（A，B）：通过 Real-TimeRT-PCR 实验结果（A）鉴定，WDR5 敲低效果达 60%（**P≤ 0.01），GAPDH 为内参，Western Blot 实验结果（B）显示 WDR5 的敲低效果明显（**P≤0.01），HSP90 为内参。以上均进行三次独立重复实验。(C，D）：通过 Real-Time RT-PCR 实验结果（C）鉴定，WDR5 过表达效果明显（**P≤0.01），GAPDH 为内参，WesternBlot 实验结果（D）显示 WDR5 的过表达效果明显（** P ≤ 0.01），HSP90 为内参。以上均进行三次独立重复实验。

成骨,间充质干细胞,实验组,分化能力

图 2 WDR5 敲低后导致间充质干细胞成骨/成牙本质向分（A）：SCAPs 由成骨诱导 WDR5 敲低组细胞 3 天后，实验磷酸酶活性较对照组（Scramsh）无明显差异；（B）：SCAP培养基诱导3周，对照组（Scramsh）钙结节形成、茜素红染色显著减弱；（C）：成骨/成牙培养基诱导 3 周时，实验组（（Scramsh）钙离子浓度显著提高（**P≤0.01）；（D）：BMSC敲低组细胞 3 天后，实验组（WDR5sh）碱性磷酸酶活性较显增强；（E）：BMSCs 由成骨/成牙本质向培养基诱导 2 周钙结节形成、茜素红染色较实验组（WDR5sh）显著减弱。

【参考文献】