BMP和Wnt信号通路在角巩缘干细胞调控中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-03 16:30

【摘要】：目的:BMP和Wnt信号通路在角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem/progenitor cells,LESCs)的调控中发挥重要作用。本研究旨在探索BMP和Wnt信号通路在LEPCs调控中所起的作用及其机制。方法:使用中性蛋白酶II和胰酶/EDTA消化大鼠角膜缘组织,将单个细胞种植于3D-Matrigel中培养,并针对BMP信号通路和Wnt信号通路分别行抑制和激活实验,q RT-PCR检测LEPCs中p63α、CK12、CEBPδ以及CK15等指标的表达,免疫荧光染色对其Smad1/5/8及β-catenin进行检测。碱烧伤法造模大鼠LSCD模型,并使用激活了Wnt信号通路的LEPCs治疗大鼠LSCD,随后使用免疫荧光染色、HE染色等方法对其角膜缘组织进行检测。结果:LEPCs在3D-Matrigel体系当中呈细胞球(cluster样)生长。LEPCs原本p Smad1/5/8弱阳性,β-catenin呈阴性。当培养体系中加入BMP4之后,p Smad1/5/8明显核表达,说明BMP信号通路激活;培养体系加入Li Cl之后,β-catenin在细胞膜上高表达,说明Wnt信号通路激活。收集培养第7天的LEPCs,通过q RT-PCR对其进行检测,BMP4组与Li Cl组之间反应细胞干性的指标p63α、CK12没有显著性差异;BMP组CEBPδ水平明显升高。反应细胞增殖能力的指标Ki-67,BMP4组Ki-67表达水平降低,而Li Cl组的Ki-67水平明显升高。BMP和Wnt信号通路阻断组的LEPCs仍呈cluster样生长,细胞团形态无明显区别。Noggin组CK12与p63α表达量均较高,而XAV939组CK12与P63α表达量均较低。凝胶电泳结果与实时定量相一致。使用激活了Wnt信号通路的LEPCs治疗LSCD大鼠之后可以发现,LEPCs明显促进角膜上皮细胞的修复和再生,减轻角膜混浊程度,且在大鼠角膜缘组织能够检测到Wnt信号通路的激活。结论:BMP信号通路的激活促进LEPCs保持静止状态,Wnt信号通路的激活增强LEPCs增殖能力,且处于未分化的自我更新状态;Wnt信号通路激活的LEPCs可促进角膜上皮的修复和再生,减轻角膜混浊程度;对Wnt信号通路的调控有望为LSCD的治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

28图 1.取 SD 大鼠角膜缘组织，获取其角膜缘上皮干细胞，于 3D-Matrigel 环境中构建角膜缘上皮干细胞体外研究模型。可见 LEPCs 在 3D-Matrigel 环境中呈cluster样生长在培养体系中加入BMP4和LiCl之后，细胞仍然呈cluster样生长，细胞团稍显紧密（图 1），但二者之间无明显差异。比例尺=100μm。A．

29图 2.BMP 和 Wnt 信号通路激活3D-Matrigel 体系中的 LEPCs 原本 Smad1/5/8 呈弱阳性，β-catenin 呈阴性。在培养体系当中加入 BMP4 之后，Smad1/5/8 明显呈现核表达，说明 BMP信号通路被激活；培养体系中加入 LiCl 之后，β-catenin 在细胞膜上呈高表达，说明 Wnt 信号通路被激活。细胞核由 DAPI 染色。

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本文编号：2739902