经典Wnt信号通路中RhoA激活降低β-catenin稳定性的机制及意义研究

发布时间：2020-07-04 05:10

【摘要】：背景:Wnt信号通路是一类由分泌型糖脂蛋白Wnt介导的信号转导途径,在胚胎发育以及成体组织稳态的维持过程中参与调控细胞的增殖、极性、死亡,从而决定细胞的命运。由于该信号通路在胚胎的背腹体轴的建立、组织和器官的形成进程中发挥着至关重要的作用,因此,深入研究Wnt信号通路的分子调控机理,对于充分了解组织或器官的发育过程以及相关疾病的发病机制具有重要的理论和实践意义。经典Wnt信号途径主要通过β-catenin的核易位来实现对靶基因的转录活性的激活,因此经典Wnt信号通路又被称为Wnt/β-catenin信号通路。当细胞没有接收Wnt信号时,胞质内的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤性息肉病基因蛋白产物(adenomatouspolyposiscoli gene product,APC)、酪蛋白激酶 1(casein kinase 1,CK1)以及糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)等组成的蛋白降解复合体招募。首先由CK1磷酸化β-catenin的Ser45位点,进而促进GSK3依次对β-catenin的Thr41、Ser37以及Ser33位点的磷酸化;磷酸化的β-catenin能够被E3泛素连接酶亚基—β-转导序列包含蛋白(β-transducin repeats containing proteins,β-Trcp)识别并结合,最终导致β-catenin泛素化并经蛋白酶体途径降解,故β-catenin无法进入细胞核激活靶基因的转录。而当Wnt配体与其受体Frizzled(FZD)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白 5/6(low-density lipoprotein receptor-related proteins 5/6,LRP5/6)共受体复合物结合时,Axin被LRP5/6的胞内端招募进而移位至细胞膜,促使Axin/APC/CK1/GSK3复合体解离。β-catenin逃离了被磷酸化后降解的命运,在细胞浆中累积并入核,结合转录因子T细胞因子1,3,4/淋巴增强子因子 1(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF1,3,4/LEF1),促进靶基因的转录和表达。值得注意的是,作为经典Wnt信号靶基因之一的分泌型靶蛋白Dickkopf 1(Dkk1),能够竞争性地结合到共受体LRP5/6上,从而破坏了 LRP5/6与Wnt配体的结合,从而以负反馈的方式抑制了经典Wnt信号。由此可见,β-catenin在细胞浆中稳定并累积是经典Wnt信号途径转导过程中的关键分子事件之一。然而,影响胞浆中β-catenin稳定性的因素众多,但相关研究仍较少且尚无定论。Rho蛋白作为小分子的鸟苷酸结合蛋白,又被称为小G蛋白(Rho small GTPase),该家族主要成员包括RhoA、Rac1以及Cdc42,它们借助鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide-exchange factors,GEFs)和 GTP 酶活化蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)实现活性形式(Rho-GTP-bound)和非活性形式(Rho-GDP-bound)之间的转换,从而作为一种“分子开关(molecular switches)”调节许多重要的信号转导途径,进而调控细胞的增殖、凋亡、分化以及细胞骨架重排和细胞迁移等。已有研究报道在经典Wnt信号通路中,Rac1的激活是β-catenin分子入核的必要条件,并且在基因水平上Rac1通过与β-catenin以及Dkk1相互作用,在胚胎期调控小鼠胚胎肢芽的发育。然而,RhoA或者Cdc42是否具有通过调节Wnt/β-catenin信号而发挥调控小鼠四肢的发育的功能尚未见研究报道。目的:1.采用体外细胞学实验方法,探究RhoA是否具有调节Wnt/β-catenin信号通路的作用;2.探究RhoA参与调节Wnt/β-catenin信号通路的具体分子机制;3.利用基因修饰小鼠明确RhoA在调控小鼠四肢发育过程中的功能。方法:1.首先在体外细胞学上(小鼠胚胎成纤维细胞,C3H10T1/2细胞系),利用GST-pull down 明确 Wnt3a 重组蛋白(recombinant Wnt3a,rWnt3a)是否能够激活RhoA,并且通过Western blot探究Wnt3a激活RhoA的分子机制,从而确证RhoA是否是经典Wnt信号通路中的成员而且受Wnt所调控;2.利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲降RhoA或其效应激酶—Rho相关激酶(Rho-associated kinase,ROCK),以及过表达持续激活形式的RhoA(consitutively activated RhoA,caRhoA)或 ROCK2(caROCK2),探究RhoA/ROCK对于rWnt3a所诱导的Lef1荧光素酶报告基因(Lef1-luciferase reporter)活性的影响,从而明确RhoA/ROCK是否能够调节经典Wnt信号;3.通过核质分离以及免疫荧光的方法,明确RhoA/ROCK对于β-catenin水平以及核质分布的调控,进一步确证RhoA/ROCK对Wnt/β-catenin信号通路的影响;4.采用Western blot、荧光素酶报告基因以及免疫荧光等方法,进一步探究RhoA/ROCK影响β-catenin水平以及核质分布的分子机制;.5.构建小鼠顶端外胚层脊(apical ectodermal ridge,AER)部位特异性(Msx2-Cre)的 RhoA 功能缺失(loss-of-function,Msx2-Cre;CT-dnRhoA+/-和Msx2-Cre;RhoAf/f)以及功能获得(gain-of-function,Msx2-Cre;caRhoA+/-)的基因修饰小鼠,取E16.5天的上述各基因型胎鼠,利用骨骼染色分析小鼠四肢表型;同时繁殖经典Wnt信号缺失时的上述各基因型小鼠(即:Msx2-Cre;Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-,Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f 以及 Msx2-Cre;Dkk1+/+;caRhoA+/-),比较分析小鼠四肢表型;此外,繁殖β-catenin缺失同时抑制RhoA的小鼠(Msx2-Cre;β-cateninf/f CAT-dnRhoA+/-),观察并分析表型;6.取E10.5胎鼠的前肢肢芽,利用原位杂交、石蜡切片Tunel染色等方法,探究RhoA的激活或缺失对AER部位纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor 8,FGF8)以及骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein 4,BMP4)mRNA水平的影响以及细胞凋亡、磷酸化β-catenin等蛋白表达水平。结果:1.在C3H10T1/2细胞株上,1)rWnt3a能够时间和剂量依赖性地激活RhoA,并且这种激活作用可以被Dkk1重组蛋白(recombinant Dkk1,rDkk1)所抑制;2)并且在人胚肾上皮细胞(HEK293T)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3、L929)等细胞株上,Wnt3a同样可以激活RhoA;3)Wnt3a通过FZD/Gαq/Dv1/Daam1信号途径激活RhoA;2.在C3H10T1/2细胞株上敲降RhoA或ROCK1/2以及利用ROCK的抑制剂Y27632均能够协同性地上调Wnt3a所诱导的Lef1荧光素酶报告基因的活性(p0.01);而激活RhoA或ROCK2则下调Wnt3a所诱导的Lef1荧光素酶报告基因的活性(p0.01);3.核质分离或免疫荧光结果显示:在C3H10T1/2细胞株上敲降RhoA或利用ROCK的抑制剂Y27632,均能够显著上调β-catenin的总蛋白水平以及细胞核、细胞浆中的β-catenin蛋白水平;而过表达caRhoA或caROCK2则显著下调β-catenin的总蛋白水平以及细胞核、细胞浆中的β-catenin蛋白水平;4.Western blot结果显示:1)Wnt3a可以通过RhoA/ROCK激活Janus激酶1/2,(Januskinase1/2,JAK1/2);2)JAK1/2 直接磷酸化 GSK3β的 Tyr216 位点,从而激活 GSK3β;3)活化的 GSK3β磷酸化β-catenin 的 Thr41、Ser37、Ser31位点,从而导致β-catenin降解;5.E16.5天胎鼠骨骼染色结果显示:1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠呈现出典型的经典Wnt信号缺失的表型,即后肢缺失,前肢不同程度截短;2)而Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠无明显发育缺陷,而当过表达Dkk1的同时抑制RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-),则能够显著挽救由于经典Wnt信号缺失导致的四肢发育缺陷,即前肢完全被挽救,且后肢也在很大程度上得到挽救;3)类似的,过表达Dkk1的同时缺失RhoA(Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f)的小鼠有着相似的挽救表型;4)另一方面,过表达Dkk 的同时激活RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-),则不能够挽救四肢发育的缺陷;5)此外,缺失β-catenin的同时抑制RhoA(Msx2-Cre;β-cateninn/f;CAT-dnRhoA+/-)也不能够挽救经典Wnt信号缺失(Msx2-Cre;β-cateninn/f)导致的四肢发育缺陷;6.原位杂交结果显示:与对照小鼠(Msx2-Cre)相比,1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠FGF8和BMP4的mRNA表达水平显著下降;2)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,上述两种基因表达水平得到挽救;3)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-基因型小鼠,上述两种基因表达水平不能得到挽救;4)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠AER部位细胞凋亡显著增加,磷酸化β-catenin水平显著增加,β-catenin总量显著下降;5)Msx2-Cre;caRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平显著增加,β-catenin总量显著下降;6)Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平显著下降,而β-catenin总量显著增加且入核显著增多。结论:1.Wnt 通过 FZD/Gαq/Dv1/Daam1 信号途径激活 RhoA;2.RhoA通过ROCK/JAK/GSK3β(Tyr216)信号途径磷酸化β-catenin,进而导致β-catenin降解,从而负向调节经典Wnt信号;3.在AER部位RhoA与Dkk1相互作用调节小鼠胚胎肢芽发育。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363
【图文】：

载体,图谱,细胞转染,转染

图２．３．４．１ｐＳｉｃｏＲ干扰载体图谱逡逑２．３．４．２慢病毒包装逡逑（１）细胞转染：消化ＨＥＫ２９３Ｔ细胞后进行计数，按照ｌｘ１0６个／ｍｌ的细胞接种到１５邋ｃｍ细胞培养皿中，待细胞融合度达９０％以上时进行细胞转染病毒包装质粒转染按照如下比例进行：目的基因的ｓｈＲＮＡ邋（对照病毒转染ｐＳｉｃｏＲ）：ｐＭＤＬ：ｐＲｅｖ：ｐＶＳＶＧ＝２：ｌ：ｌ：ｌ，每个１５ｃｍ的细胞培养皿共转染５０｜ｉｇ。转染操作步骤参照２．３．３．２质粒转染操作方法进行；逡逑（２）病毒包装：转染后６邋ｈ，将培养基换成不含双抗的ＤＭＥＭ高糖培养１０％ＦＢＳ）继续培养４８ｈ，收集第一批培养上清；再换入新鲜的不含双抗的Ｄ高糖培养基（含１０％ＦＢＳ邋）继续培养２４邋ｈ，收集第二批培养上清；逡逑（３）将两批培养上清混合，常温ｌＯＯＯｒｐｍ转速离心１０邋ｍｉｎ，取上清，

条件性,小鼠,构建策略,序列

浙江大学博士学位论文逦材料和方法逡逑因组沉淀），溶于２００邋ｐｌｄｄＨ２０中，５５邋°Ｃ杂交炉中继续孵育过夜，而后即逡逑得小鼠基因组，可用于基因型鉴定。逡逑２．３．１３．２偷Ｊ条件性敲除小鼠的构建逡逑（１邋）委托南京大学模式动物研究所利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术构建条件性逡逑局支除小鼠；逡逑（２）敲除策略如图２．３．１３．２所示；逡逑ＲｈｏＡ邋＼ｏｃｒｎ逡逑

【参考文献】