类鼻疽伯克霍尔德菌Hfq伴侣蛋白相关mRNA文库的构建及测序分析

发布时间：2020-07-04 05:54

【摘要】：目的Hfq与s RNA结合,它们的结合体通过s RNA与靶m RNA进行配对相互作用,通过该结合机制寻找相关靶m RNA是研究其调节功能的主要手段,本文旨在寻找B.p C006中Hfq相关m RNA,为进一步研究m RNA生物学功能和致病机制打下基础。方法1)PCR扩增B.p C006菌株的Hfq基因并亚克隆至p MD19-T克隆载体中,经测序验证后,用Ndel和Xhol双酶切p MD19T-Hfq与p ET30a(+),然后插入目的基因以构建重组表达质粒p ET30a(+)-Hfq。重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG最佳剂量浓度诱导目的基因表达,提取其表达产物利用SDS-PAGE与Western blot分析鉴定,确定目的蛋白,最后经过Ni2+螯合柱纯化表达产物以取得目的蛋白;2)将前期实验得到的重组表达质粒p ET30a(+)-Hfq转化入大肠埃希菌S17中,随后挑取阳性单克隆以做菌液PCR验证,利用重组质粒S17/p ET30a(+)-Hfq接合入B.p C006,IPTG诱导目的蛋白Hfq表达,将细菌破碎提取上清,并利用His-tag单抗通过免疫共沉淀方法分离Hfq与其结合的RNA,利用TRIzol Universal提取RISC复合物中的RNA,采用Nano drop测所得RNA的浓度,取出部分RNA进行后续实验,其余逆转录为c DNA放液氮速冻并保存以后续送高通量测序并构建m RNA子文库。结果1)以临床B.p C006菌株DNA为模板,利用PCR扩增,其结果与Hfq基因理论值预期大小的片段一致;2)经双酶切和测序验证亚克隆质粒与原核表达质粒构建成功;3)利用IPTG最佳剂量浓度诱导大肠埃希菌BL21(DE3)中的His-Hfq的融合蛋白,蛋白电泳显示约9.4k Da;4)通过His标签蛋白纯化试剂盒及Western blot分析鉴定获得单一条带的目的蛋白;5)重组质粒S17/p ET30a(+)-Hfq接合入B.p C006后经PCR验证得到阳性单克隆;6)利用His-tag单抗体通过免疫共沉淀方法分离得到与Hfq结合的相关RNA;7)高通量测序构建Hfq相关m RNA子文库,总共检测到的基因数目有4185个,其中检测到的已知基因数目有4155个,检测到的新基因数目有30个。新基因中运用KEGG Pathway分析及预测发现有5个基因都可以在KEGG-A-class与KEGG-B-class信号通路中找到,预测其可能有新陈代谢、环境信息加工、膜转运、氨基酸代谢及其他次生代谢的生物合成功能;8)附加发现9个Hfq相关s RNA。结论1)原核表达质粒构建成功;2)在大肠埃希菌中His-Hfq融合蛋白成功表达,并经过Ni2+柱纯化得到了s RNA伴侣蛋白Hfq;3)Hfq相关m RNA文库被成功构建且进行转录组分析、多态性、插入突变、RNA基因编辑及基因结构优化等,为进一步钻研这些m RNA的功能提供了根底,研究B.P的m RNA功能可能会揭示B.P某方面的致病机制,从而找到相应的治疗靶点;4)附加发现9个Hfq相关s RNA,同时为筛选与该蛋白相关生物s RNA奠定基础。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378
【图文】：

物理图谱,物理图谱,克隆载体,离心管

将柱子从化从新放回收集离心管。7 向吸附柱中加入 600μLWash Solution，12000rpm 离心 30sec。弃掉废液，将柱子从化从新放回收集离心管。重复步骤 7。8 将上述空吸附柱从新放入收集离心管中，放入低温离心机，高速离心3min，丢掉离心管，重用新离心管。9 用中号移液器在吸附膜中央加入 30μLElution Buffer，室温搁置 4min，高速离心 1min。将通过上述胶回收并纯化过程得到的 DNA 溶液测浓度及纯度后标记好并置-20℃保存或用于后续实验。1.1.4 重组表达质粒 pET30a（+）-Hfq 的构建及鉴定将纯化的 PCR 产物与 pMD19- T 载体（图 1-1）进行 T-A 克隆，并转化，随后将转化菌涂铺在含 100mg.L－１Amp（氨苄霉素）的 LB 固体培育营养基上，37℃恒温培养过夜。次日挑其单克隆经 PCR 验证并经测序验证（华大基因），BLAST 分析测序结果，最终确认获得 pMD19T- Hfq 亚克隆载体。

亚克隆,反应条件,反应体系,试剂

图 1-2 原核表达载体 pET30a（+）的酶切位点Fig.1-2 Prokaryotic expression vector pET30a(+) restriction site（1）10μL 亚克隆反应体系，反应条件：22℃，30min。试剂体积（μL）pMD19-TVector（50ng/μL）1.0PCR 纯化产物 1.0Solution I 8.0按前述方法提取质粒 pM D19T-Hfq 与 pET30a（+），用 Ndel 和 Xhol 分别双酶切 pM D19T-Hfq 与 pET30a（+）质粒（图 1-2），按步骤回收与纯化Hfq 基因，并将 Hfq 基因连接到原核表达载体 pET30a(+)的 Ndel 和 Xhol 酶切

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