贝氏柯克斯体类脂A生物学作用及菌体耐高渗透压机制研究

发布时间：2020-07-07 01:52

【摘要】：贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称C.burnetii)是一类世界范围广泛分布的革兰阴性胞内寄生菌,该菌通常以气溶胶吸入的方式传播感染人,引起人类急性或慢性Q热病。传统上,由于贝氏柯克斯体与立克次体具有相似的生物学特性,因而又俗称Q热立克次体。近年来研究发现贝氏柯克斯体与立克次体科内其他成员的亲缘关系较远,在第二版的《伯杰氏系统细菌学手册》中该菌归属于军团菌目、柯克斯体科、柯克斯体属。值得注意的是,该病原体对高渗透压、干燥脱水等环境具有极强的抵抗存活特性,是一类经典的生物战剂与生物恐怖剂。脂多糖(Lipopolysaccharide,简称LPS)是大多数革兰阴性细菌菌体外膜的主要结构,是一种重要的毒力因子。除少数菌例外如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,简称Ct)等,均由类脂A、核心糖、多糖(O抗原)三部分组成,是重要的毒力因子与保护性抗原。类脂A是革兰阴性菌的内毒素,葡萄糖胺结构的双糖脂,脂多糖的基础组分。目前除少数菌如脑膜炎奈瑟氏菌、卡他莫拉菌和鲍曼不动杆菌之外,Kdo-lipid A为大多数革兰阴性菌正常生长繁殖的必需结构。LpxC是类脂A合成途径中催化第一步脱乙酰化反应的保守酶,该反应不可逆,常被用作革兰阴性菌抗生素的设计靶点。新型小分子化合物抑制剂如LPC-011、CHIR-90能够特异性结合抑制LpxC的活性,从而有效抑制类脂A的合成,达到化学法敲除类脂A的目的。近年来,关于贝氏柯克斯体脂多糖的研究中,类脂A的生物学作用与功能目前仍不明确。我们通过使用新型小分子LpxC抑制剂LPC-011、CHIR-90等,在无细胞培养基(ACCM-2)、猴肾细胞系(Vero、BGMK)、巨噬样THP-1细胞等多种贝氏柯克斯体的培养环境内研究了类脂A对于菌体生长繁殖的重要性,初步分析了其生物学功能。此外,以无细胞培养体系为研究平台,利用双向电泳结合质谱技术筛选出多个与菌体耐高渗透压适应性存活特性相关的蛋白。首先,初步研究发现:初始加入单一高浓度的抑制剂LPC-011并不影响I相、II相贝氏柯克斯体在Vero细胞内生长繁殖,这提示类脂A对于贝氏柯克斯体在该环境下的生长繁殖过程可能并不重要。然而,由于缺乏有效的类脂A检测方法以及贝氏柯克斯体LpxC对于抑制剂的敏感性未知,因此并不能得出关于类脂A必要性的准确结论。为了进一步评价贝氏柯克斯体LpxC对于抑制剂LPC-011的敏感性(MIC),利用遗传操作将贝氏柯克斯体lpxC基因引入大肠埃希菌(E.coli,简称大肠杆菌),同时敲除大肠杆菌内源染色体上的lpxC完成构建大肠杆菌替代测试模型。在大肠杆菌替代模型中对比测试发现,抑制剂LPC-011对贝氏柯克斯体LpxC的最低抑制浓度小于0.05μg/ml,且小于LPC-011对大肠杆菌的最小抑菌浓度。这提示我们可以利用大肠杆菌作为参考指标,判断抑制剂的稳定性与抑制效果。考虑到贝氏柯克斯体的培养周期长达7天,且抑制剂LPC-011在动物体内实验中不稳定等特点,利用大肠杆菌的生长指标OD_(550)作为参照,评价抑制剂LPC-011的抑制效果。发现在细胞环境中,初始加入大肠杆菌致死剂量(2μg/ml40×MIC)的LPC-011能够在48 h内保持稳定的大肠杆菌抑菌浓度。因此间隔48 h更换含有2μg/ml LPC-011的培养液可保持大肠杆菌抑菌浓度。然而,在无细胞培养体系中,初始加入5μg/ml LPC-011经培养7天后,仍可维持大肠杆菌抑菌浓度。由于缺乏类脂A检测手段,实验构建了穿梭载体pMMBGK,进而引入衣原体kdtA成功构建穿梭质粒pMMBGKkdt A。以上两种质粒均具有RSF1010复制起始位点。将质粒pMMBGKkdt A电转化进入贝氏柯克斯体九里II株,使衣原体Kdo转移酶Kdt A表达,催化合成衣原体属特异性Kdo侧链,修饰贝氏柯克斯体类脂A,将Kdo_2-lipid A修饰形成Kdo_3-lipid A,在贝氏柯克斯体外膜形成可被抗衣原体属特异性单抗识别的α-Kdo-(2→8)-α-Kdo表位结构。在抑制剂LPC-011作用下,通过间接免疫荧光染色验证了贝氏柯克斯体类脂A的合成确实受到显著抑制,同时亲代转化菌在非吞噬细胞、无细胞生长环境内的拷贝数产量下降。经抑制剂培养所得子代菌体能够正常感染吞噬、非吞噬细胞,但在LPC-011的作用下几乎不能在吞噬细胞THP-1中进行生长繁殖。然而,类脂A修饰菌的实验结果并不能完全替代野生型贝氏柯克斯体的测试结果。在对野生型I相、II相贝氏柯克斯体的测试研究中发现,在BGMK细胞培养体系中,LPC-011降低了囊泡数量(约60%~70%),但是已发育成熟囊泡内菌体的生长繁殖未受影响。有意思的是,经LPC-011处理的I相菌体,其囊泡内菌体的生长表型仍表现为分散的布朗运动,这提示完整的脂多糖可能并不是导致I相菌体亲水性的唯一原因。在经抑制剂LPC-011处理的THP-1细胞中,贝氏柯克斯体仅可形成缺陷生长的小囊泡,同时菌体拷贝数下降显著。经LPC-011培养所得子代菌仍可感染THP-1细胞、在胞内正常生长。由于贝氏柯克斯体发育过程中包含形态迥异的小贝氏体(SCV,直径0.2~0.5μm)、大贝氏体(LCV,直径1μm)的双相发育周期,因此使用透射电子显微镜(TEM)分析类脂A对于菌体的形态学发育变化的生物学作用,发现在LPC-011处理的吞噬、非吞噬细胞中,类脂A并不是大贝氏体向小贝氏体发育变化的必需结构。另外,通过改变无细胞培养体系中Na~+与Cl~-浓度来大量获取不同渗透压梯度下的菌体,并分别对三组:超高渗、正常高渗、低渗环境所得菌体蛋白进行双向电泳分析银染显色。基于蛋白点灰度值,用软件对比分析得出三组渗透压条件下表达量具有显著性差异的13个蛋白,进行质谱(Maldi-TOF-MS)分析。其中,超高渗组中Gro ES、EF-Tu、RopC、IcmK、RplL蛋白以及假定蛋白(CBU_0632)的表达量均升高10倍以上。低渗组中,蛋白GcvH、Bcp、Dot C、、RuvB、鸟氨酸脱羧酶、以及假定蛋白(CBU_0658)的灰度变化均达10倍以上。综上所述,本研究通过使用抑制剂LPC-011在多种培养体系内鉴定了贝氏柯克斯体类脂A的生物学作用,利用大肠杆菌替代模型测试了贝氏柯克斯体LpxC对于LPC-011的敏感性,建立了一个基于间接免疫荧光染色的贝氏柯克斯体类脂A检测报告系统,进而提出证据证明贝氏柯克斯体类脂A在三种培养环境下(猴肾成纤维细胞、吞噬细胞、无细胞培养基),具有不同的生物学作用。另外,通过蛋白质组学分析鉴定得出与菌体耐高渗透压特性相关的蛋白及其编码基因。本研究为下一步构建贝氏柯克斯体类脂A无痕删除突变株奠定了基础,为更加深入分析类脂A的生物学功能提供了实验依据。对临床上治疗急性、慢性Q热提供了新的思路。也为进一步在转录水平研究贝氏柯克斯体耐高渗透压的遗传学机制、验证相关基因的生物学功能提供了实验基础。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R376
【图文】：

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图 1.1 脂多糖合成途径与 LpxC 抑制剂作用机制示意图抑制剂（LPC-011，CHIR-90）特异性结合抑制 LpxC 的活性，进而有效抑制革兰阴性菌类脂 A 与脂多糖的合成。图 1.2 LPC-011 结合抑制 LpxC 三维结构示意图

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第 7 页图 1.2 LPC-011 结合抑制 LpxC 三维结构示意图细胞与质粒名称来源氏柯克斯体九里 II 相菌株柯克斯体 Henzerling I 相菌株 coli BL21(DE3)感受态细胞E. coli TOP10 感受态细胞本实验室收集保存本实验室收集保存天根生化科技有限公司（北天根生化科技有限公司（北

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军事科学院博士学位论文入单一高浓度（2 μg，>40×MIC）抑制剂 LPC-011 抑制贝氏柯克斯体类脂 A 的合成。利用相差显微镜连续观察囊泡、菌体的生长繁殖形态。观察抑制剂 LPC-01对贝氏柯克斯体生长表型的影响，初步判断类脂 A 对于贝氏柯克斯体在胞内生长繁殖过程中是否具有重要的生物学作用。如图 1.3 所示。

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