大肠埃希菌复制起始蛋白DnaA可逆乙酰化修饰对DNA复制起始调控的研究

发布时间：2020-07-07 00:35

【摘要】：对大部分生命体来说,染色体的复制起始和调节是重要的生命活动。能否正确地进行复制起始决定了细胞的命运。细胞需要在合适的环境下开始复制起始,又必须在恶劣的环境下阻止复制起始。在细菌中,复制起始蛋白DnaA是DNA复制起始过程的关键蛋白。在E.coli中有多种机制来确保染色体正确地复制起始,其中一部分机制是通过调控ATP-DnaA的活性来实现的,包括RIDA(Regulatory inactivation of DnaA)和DARS(DnaA-reactivating sequence)等。DnaA属于AAA+蛋白家族成员,含有保守的Walker A及Walker B motifs。这两个motifs对DnaA蛋白的ATP/ADP结合至关重要。近些年的研究发现,蛋白赖氨酸的乙酰化修饰在细胞的生命活动中扮演着重要的角色。我们的研究表明,DnaA可以在体外被乙酰化酶Pat及乙酰磷酸(acetyl-phosphate,AcP)乙酰化修饰,也可以被去乙酰化酶CobB去乙酰化修饰。为了更好地研究DnaA乙酰化修饰的生理意义,我们通过knock-in的方法在E.coli基因组上dnaA的N-端敲入His标签,并通过亲和纯化的方法获得生理状态DnaA。检测生理状态DnaA乙酰化水平,我们发现E.coli WT菌株中,从迟缓期到平台期,DnaA乙酰化程度逐渐升高。与WT中DnaA乙酰化水平相比,?cobB菌株中DnaA乙酰化水平上升,而?pat菌株中DnaA乙酰化水平下降。AckA为乙酸激酶,可以把乙酰磷酸转化为乙酸;Pta为磷酸转乙酰酶,可以把乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A。我们构建了E.coli的ackA-pta双敲株,ackA-pta双敲株的胞内乙酰磷酸浓度较低。我们还发现,?ackApta菌株中平台期DnaA乙酰化水平明显下降。细胞周期分析表明,与WT相比,?cobB、?pat、?ackApta菌株DNA复制起始频率也发生了变化。这表明生理状态下,CobB/Pat及乙酰磷酸都参与调节了DnaA的乙酰化修饰并影响了DNA的复制起始频率。通过LC/ESI/MS鉴定,我们发现生理状态下DnaA的23个赖氨酸位点中有17个位点被乙酰化修饰,其中有位于比较保守的Walker A motif上的K178位,通过质粒互补试验筛选,该位点比较重要。对该位点进行定点乙酰化修饰后检测其功能,发现DnaA(K178Ac)丧失了与ATP及ADP的结合能力,与复制起始点oriC的结合能力有很大程度的减弱。这表明,K178的乙酰化修饰可以降低DnaA的活性。而且DnaA(K178Ac)与dnaA启动子的结合能力也减弱了,这表明DnaA的乙酰化修饰有可能也参与了dnaA基因转录的自调控过程。除此之外,我们还发现K178位的乙酰化修饰可以被CobB去除。以上的发现表明E.coli可以通过调节DnaA的乙酰化修饰来改变DnaA的活性进而对DNA的复制起始频率进行调节。这是一个全新的复制起始调控机制,我们的研究拓宽了人们对原核生物复制起始调控机制的认识。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【图文】：

复制体,大肠埃希菌,聚合酶,亚基

物中 DNA 聚合酶除外），只能从一个已存在的 3'端羟基始 DNA 合成所必需的[24]。肠杆菌中，已发现 5 种 DNA 聚合酶，分别为 DNA 聚合酶中聚合酶 III 为多亚基复合体，负责从头合成新链 DNA， DNA 的修复[25, 26]。在真核生物中，有 9 种 DNA 聚合酶细胞核 DNA 的复制，γ 负责线粒体中 DNA 的合成，其它核 DNA 的修复（β、ζ、κ、η）或减数分裂（ι）[27]。杆菌的 DNA 聚合酶 III 全酶（holoenzyme）由 10 个蛋白质包括两份拷贝的催化核心（亚基、亚基、θ 亚基），两份蛋白（τ 亚基），两份拷贝的具有前进能力的 β 夹钳及 5 个蛋机（图 1）[28, 29]。β 夹钳控制了核心酶与蛋白质的结合，NA 链上快速滑动，而两份拷贝的催化核心可以同时合成先导冈崎片段（Okazaki fragment）[29, 30]。

示意图,基因组,原位,标签

基因的一部分。引物 His-Ec DnaAR1，F2，R2，F3，R3，F4 皆含有相邻片段的20 个碱基，这对融合 PCR 成功与否非常关键。图7 基因组 dnaA 原位敲入6HIS 标签示意图Figure 7 The schematic of the fused with a 6HIS-tag at the N-terminus of chromosomal dnaA2.2.3.4 PCR 产物的制备融合 PCR 比普通 PCR 稍显复杂，PCR 产物须三步反应才能得到。步骤如下：1. 融合片段的制备：分别以 His-Ec DnaA F1，R1（退火温度：45 ℃）、F2，R2（退火温度：49 ℃）、F3，R3（退火温度：45 ℃）、F4，R4（退火温度：55 ℃）为引物，以 MG1655基因组或 pKD3为模板，扩增出要融合的4个 DNA 片段。50μLPCR 反应体系如下：10×Pfu buffer（含 MgCl2） 5 μL2.5 mM dNTP 5 μL10 μM Primer F 1 μL10 μM Primer R 1 μLTemplate DNA 0.5 μLPfu polymerase 0.6 Udd H2O 36.9 μLPCR 反应结束后用1% Agarose 胶电泳鉴定片段的纯度与浓度

过表达,脱盐,状态,图片

将膜表面用滤纸轻轻吸干，使 A、B 混合液均匀平铺n 后通过化学发光检测仪检测显色结果。保存图片后对图片通灰度扫描，计算出相对灰度值，分析蛋白水平及乙酰化水平结果状态 DnaA 蛋白的获得材料与方法中叙述的步骤，我们获得了 DnaA 蛋白的表达质cdnaA，并将该质粒置于表达菌株 BL21 中诱导表达，最终纯的 DnaA 蛋白，见图 8 箭头所指处。我们选择 desalting-6 泳后续实验，因为该管蛋白在纯度上相对较高。

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