中国柯萨奇病毒A组16型基因组特征及病毒样颗粒疫苗的初步研究
发布时间：2020-07-07 17:01
【摘要】：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16, CVA16)属小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus),是手足口病(Hand-foot-and-mouth Disease, HFMD)的主要致病原之一,常与另一重要病原体肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV-A71)交替或共同流行。CVA16多引起儿童的HFMD,疱疹性咽峡炎等自限性疾病,但亦可引起患者出现心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎和肺炎等重症并发症,甚至可导致死亡。CVA16在我国多个地区引起过暴发流行,成为重要的公共卫生问题。目前尚无控制CVA16感染的有效药物及手段。随着EV-A71疫苗的即将上市,CVA16所引发的HFMD等疾病的流行将更加引起大家的重视。目前国内外多家研究机构致力于CVA16疫苗的研究,取得了很大的进展,但至今仍未开发出具有医药应用价值的疫苗。目前研究的疫苗形式包括全病毒灭活疫苗、病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗、重组VP1亚单位疫苗、DNA疫苗等类型。病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗由于形态上与天然病毒粒子相似、具有更全的抗原表位、不含感染性的核酸、安全性更高,是一种更具开发潜力的新型疫苗类型。CVA16 VLPs疫苗虽然之前有过报道,但缺乏更深入的研究,如不同免疫途径对免疫效果的影响,够疫产生的特异性抗体的变化规律,及对机体产生保护作用的具体指标均没有详细的报道。因此,研究我国CVA16流行株基因特征,评估CVA16 VLPs疫苗的免疫保护性,对我国CVA16疫苗的研发儿有重要的参考价值。本研究通过对我国CVA16代表株的全基因序列的测定,阐明我国CVA16的分子流行病学情况及其全基因组特征。鉴定筛选了CVA16疫苗候选株,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了较高纯度的CVA16 VLPs。并应用灭活CVA16及重组衣壳蛋白VP1做免疫比较,利用ICR小鼠模型评价该疫苗刺激产生的体液免疫和细胞免疫效果,并对该疫苗的保护性进行了评估 通过对新生乳鼠攻毒后组织器官的病理学、免疫组化及病毒载量的检测,进一步分析了病毒侵入机体后增殖的动态变化过程及对各个组织器官造成的损伤,更为深入的阐释了对候选疫苗的免疫原性和免疫保护作用进行全面评估的价值及意义。结果表明,该VLPs疫苗对小鼠具有良好的免疫保护效果,能有效阻止病毒对机体的侵袭及增殖,是极具开发前景的疫苗形式。本研究工作主要包括3个部分。第一部分：我国CVA16代表株基因组基因特征分析我们挑选具有代表性的CVA16阳性株,应用特异性引物对其全基因组进行扩增,并进行核苷酸序列测定。将VPl序列及全基因组序列分别与GenBank中CVA16序列进行比对,并应用Bio Edit、MEGA及Sim plot软件进行种系进化分析、基因组特征及重组分析。结果发现我国现在流行的CVA16均为B1亚型中的B1a和B1b进化支,一直没有B1c进化支的报道；且中国大陆CVA16的流行亚型也未发现有明显的地域性差异,不同地区流行的毒株在亲缘关系树上无明显的分簇。全基因组研究发现,中国流行的CVA16是多种A组肠道病毒的多重重组病毒,重组主要发生在5'UTR及非结构蛋白P2、P3编码区。CVA16 B1a及B1b进化支在传播流行过程中,比较稳定；亚型内及亚型间均具有较高的核苷酸及氨基酸同源性。推测中国所有流行株可能为同一祖先独立进化而来。CVA16这种缓慢的进化及变异成为疫苗开发的一个有利条件。第二部分：CVA16 VLPs疫苗的制备及鉴定根据本研究中分子流行病学研究结果及流行现状,我们选取CVA16 B1b亚型毒株521-01T作为CVA16疫苗研制的候选株。对病毒P1及3CD蛋白的全长编码基因进行密码子优化后克隆入同一杆状病毒穿梭质粒pFastBac-Dual中,Pl及3CD分别由启动子PPH及Pp10控制。进一进对质粒启动子进行改造,将控制3CD的P10启动子改为启动效率稍你的('MV启动子。分别构建出重组杆状病毒表达质粒Bacmid-P1-3CD及Bacmid-C-P1-3CD转染Sf9虫细胞获得表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)及AcMNPV-C-P1-3CD).使用IFA、Western-blot及电镜对表达产物进行鉴定和分析 通过优化MOI仇及表达时间,并应用悬浮培养的Sf9细胞进行VLPs的大量表达；层析及密度梯度离心法纯化VLPs颗粒。同时,应用VERO细胞培养并获得纯化的灭活CVA16全病毒,并应用原核表达体系,获得纯化并复性的病毒衣壳蛋白VP1,分别进行鉴定。结果显示,表达的P1蛋白前体被3CD蛋白酶切割为衣壳蛋白VP0、VP1及VP3并自主装配成了CVA16 VLPs,且该VLPs结构完整,大小位于25-30nm之间,与完整病毒颗粒一致。且启动子改造后能明显提高VLPs的表达量。通过超速离心纯化获得了高纯度的CVA16 VLPs。并获得纯化的CVA16灭活病毒及充足VP1蛋白。第三部分：CVA16 VLPs疫苗的免疫学特性研究选用6周龄雌性ICR小鼠为实验动物模型评估三种抗原免疫效果。优化免疫剂量,并将三种抗原分别配伍Al(OH)3佐剂及CpG佐剂以肌肉注射的方式,配伍CpG佐剂以滴鼻免疫的方式在第0天、14天和28天进行三次免疫。通过检测CVA16特异性抗体、中和抗体滴度和T细胞免疫反应来探讨抗原刺激机体所产生的细胞和体液免疫效果,并通过对免疫后小鼠配种所产乳鼠病毒攻击实验来评价三种疫苗对小鼠产生的被动保护作用。并对实验乳鼠的组织器官进行HE染色、免疫组化等实验分析,获得病理损伤和病原学变化资料,从而揭示疫苗对小鼠产生的保护作用机制。结果显示,注射免疫途径：CVA16 VLPs和灭活CVA16全病毒组均能刺激机体产生高水平的特异性抗体(血清IgG抗体均可达1:2×105)。VLPs诱导抗体中和活性与灭活CVA16相当,均可达到1：512。T细胞免疫检测结果发现,CVA16 VLPs可刺激小鼠机体产生较好的细胞免疫反应,机体产生的特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞数目与灭活CVA16全病毒组的相当(P0.05),可以推测CVA16 VLPs免疫小鼠能同时诱导机体Th1和Th2型细胞免疫反应。黏膜免疫途径：灭活CVA16全病毒组无论在体液免疫还是细胞免疫效果方面均略优于CVA16 VLPs组(P0.05)。且sIgA检测结果发现,除呼吸道中二者sIgA滴度均可达210以上(P0.05), CVA16全病毒组在肠道及阴道灌洗液中sIgA滴度要高于CVA16 VLPs组。而VP1免疫组虽然可以诱导高滴度的IgG抗体,但该抗体中和效价均低于1:8,且细胞免疫水平均明显低于VLPs免疫组(P 0.05),而且几乎检测不到sIgA。被动免疫保护实验结果表明,CVA16 VLPs及灭活疫苗免疫组小鼠均能对1 000LD50同株病毒及400LD50异种病毒的攻击具有100%的保护。且最高对于16000LD5o同株病毒的攻击,VLPs组及CAV组仍分别具有92.3%及90%的保护力；VLPs免疫组对2400 LD5o异株病毒的攻击仍具有90%的保护。病理学检测结果显示,PBS对照组多个组织器官均出现病理性变化,以后肢肌肉、肠组织、肺脏最为严重；出现了严重的肌纤维萎缩、坏死、炎细胞浸润,肠壁水肿坏死、绒毛脱落,肺泡壁增厚、水肿等病理学变化。CVA16 VLPs及灭活病毒免疫组在各个组织器官(脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、后肢骨骼肌、脊柱骨骼肌及脊髓)均无组织病理学变化。器官病原学分布与病理表现基本一致,PBS对照组各个组织器官中均可检测到大量病毒存在。但免疫组小鼠在后肢骨骼肌组织、肠组织等处可检测到微量的病毒抗原存在,其余器官病原学分布皆呈阴性。以上结果说明CVA16 VLPs可诱导小鼠机体产生有效的免疫应答反应；且该中和抗体能明显抑制病毒在小鼠体内一些组织器官中的增殖,能在很大程度上够阻止病毒的感染,有效的保护机体免受病毒感染所引起的病理损害。本研究阐明了我国CVA16病毒代表株的全基因组基因特征,成功构建并证实了CVA16 VLPs具有和灭活疫苗相同的保护作用,说明CVA16 VLPs疫苗是—种很有开发前景的候选疫苗。这些结果为进一步对CVA16 VLPs组装及结构功能进行深入研究、以及进行下游的开发和免疫学方面的研究提供了参考,为CVA16疫苗的研制提供了重要的实验依据。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392-33
【图文】：
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本文编号：2745367
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392-33
【图文】：
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本文编号：2745367
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