利用基因剔除小鼠模型研究MrgF和Agk的生物学功能

发布时间：2020-07-07 16:30

【摘要】：第一部分孤儿G蛋白偶联受体MrgF在伤害性感受中的作用研究利用小鼠基因敲除技术,从整体动物水平来研究基因功能、人类疾病发病机制、胚胎发育过程和寻找新的药物靶点,已成为现代生物学各个研究领域最常用的技术手段之一。孤儿G蛋白偶联受体MrgF属于Mas相关G蛋白偶联受体家族成员之一,其配基和生物学功能未知。该家族大部分成员的mRNA特异性地选择分布于与痛觉产生和传导相关的感觉传入神经元上,提示该家族受体可能参与了对疼痛的感受和调节的神经回路。我们在前期实验中通过大量的文献阅读和生物信息学分析,成功建立了MrgF基因剔除小鼠。通过一系列的行为学实验,发现MrgF基因剔除小鼠与同窝野生型小鼠相比对外周热痛觉和痒觉的感受没有显著性差异,而在辣椒素和福尔马林诱导的炎性痛模型上与正常野生型小鼠相比有显著性改变,表现出对伤害性疼痛耐受增加,痛敏水平降低。进一步的研究中显示MrgF受体的表达特异性地分布于小脑的浦肯野细胞和脊髓背根神经节感受神经元上。背根神经节内Creb介导的磷酸化水平影响了疼痛相关c-fos和Penk基因的表达。在疼痛产生中发挥重要作用的Runx1、电压门控钠通道Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9在MrgF基因剔除小鼠都发生了显著性下降。实验结果显示MrgF受体在伤害感受中扮演着重要的角色,进一步补充了对Mrgs受体家族功能的研究。第二部分Agk基因与线粒体病的相关性研究线粒体病是由于线粒体DNA或细胞核DNA遗传缺损,引起线粒体结构或功能的缺陷致使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组疾病的表现。疾病的症状复杂多样,确诊困难,目前没有有效的治疗方法。通过携带有线粒体DNA突变或细胞核DNA突变的线粒体病小鼠模型研究线粒体功能障碍与疾病的因果关系,对发现新的治疗线粒体病的方法有重要意义。Sengers综合征(MIM 212350)是一类由细胞核基因AGK突变引起的线粒体病,为常染色体隐性遗传性疾病。该病的主要临床症状表现为先天性白内障、肥厚性心肌病、骨骼肌病变、运动耐受力缺乏以及乳酸酸中毒。AGK基因结构的改变产生线粒体病的分子机制目前仍不是很明确。我们通过条件性基因剔除技术建立了Agk条件性基因剔除小鼠,并进一步通过生殖系统表达的Cre小鼠实现了Agk基因的全身性敲除。Agk基因剔除纯合子小鼠心肌、骨骼肌表现出与人类Sengers综合征相似的组织病理改变,出现了线粒体氧化磷酸化水平下降和线粒体结构功能受损,但没有出现Sengers综合征的先天性白内障表型。基因剔除纯合子小鼠MEF细胞线粒体膜电位下降,提示Agk基因缺失导致的细胞异常凋亡,与Sengers综合征的发生密切相关。Agk基因剔除小鼠的建立,有助于我们从整体动物水平阐明线粒体病发生、发展的生理、病理机制,并可为寻找新的药物靶点提供了实验基础。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R402
【图文】：

系统发生树,家族

rg受体家族是2001年发现的一类疼痛相关的新型G蛋白偶联受体，的基因与MAS1原癌基因具有35%的同源性，因此命名为Mas相关G（Mas-related G protein-coupled receptors, Mrgs）[14]。Mrg家族大部NA特异性地以非重叠形式表达于背根神经节（dorsal root ganglion, 神经节（trigeminal ganglion, TG）的伤害感受神经元上[14, 15]，这些信息传入的第一级神经元[16]，因此这些受体被定义为感觉神经元特ensory Neuron-Specific Receptors, SNSRs）[15]。这种特异性表达模式体可能参与了对疼痛的调节的多条神经回路。根据序列同源性，M步被分成很多亚家族，其中MrgA，MrgB和MrgC亚家族仅在啮齿达，包含大约50种相关基因[17]，另外有6种Mrg的单拷贝基因包括，MrgF（RTA），MrgG，MrgH和Mas1在啮齿类和人类中有明确的同图1.1）。

信号通路,经典,G蛋白

侧的效应器起作用，而是通过与之偶联的G蛋白，进一步通过内多种下游基因的表达变化，从而引起细胞的各种生物学效应、吞噬、分泌、收缩和电生理活动等[4, 19]。GPCRs典型的传递异性的配体与GPCRs的配体结合域结合，导致受体被激活，分化，从而对下游的G蛋白复合物产生影响。G蛋白复合物是由部分组成的异源三聚体，按照Gα亚基的结构和作用的不同，白（Gs）和抑制型G蛋白（Gi），以及Gq和G12，各亚型基因序性[20]。Gs的α亚基Gα在未被激活前，与Gβ和Gγ组成的二聚体体，且被GDP结合从而呈现无活性状态。当GPCRs与配体由于构象的变化诱发G蛋白复合物上的Gα-GDP与GTP交态的Gα-GTP，同时，Gα-GTP与Gβγ二聚体分离并移动到上的腺苷酸环化酶部位以激活腺苷酸环化酶，后者催化作为细胞内第二信使继续向下传递信号（图1.2）[21]。

物种,小鼠,基因,氨基酸

小鼠 MrgF 基因又称为 Mrgprf、Mgrc、BC019711，1990 年 Ross 等人克隆了大鼠的 MrgF 基因，他们称之为 RTA 基因。大鼠的 RTA 基因编码 343 个氨基酸的蛋白质，同时通过 cDNA 文库比较，发现该基因是与 MAS1 癌基因有 34%同源性的具有 7 个跨膜结构域的 GPCRs[51]。MrgF 基因在大部分哺乳动物中都有同源基因，包括人类、黑猩猩、恒河猴、牛、猪、啮齿类等（图 1）。小鼠 MrgF 基因定位于小鼠 7 号染色体 F5 区，长 8.6 kb，包含 3 个外显子，开放阅读框为 1032 bp，蛋白产物有 343 个氨基酸。用 Blastp 程序进行人与小鼠的 MrgF 蛋白序列比对，结果显示小鼠 MrgF 与人 MRGF 同源性高达 86%（图 2）。小鼠 MrgF 蛋白 N 端有 44 个氨基酸，C 端有 49 个氨基酸，具有特征性的 7 个 α螺旋跨膜区（7TM)结构域（图 3），属于 G 蛋白偶联受体超家族的视紫红质亚家族（Rhodopsin family G-protein coupled receptors）。作为受体蛋白 MrgF 有 G 蛋白偶联受体活性和信号传导活性，其配基和生物学功能未知，是一类孤儿 GPCRs（orphan GPCRs，oGPCRs）。

【相似文献】