耐辐射奇球菌PprM蛋白靶DNA的筛选与鉴定

发布时间：2020-07-08 13:22

【摘要】：背景与目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是地球上已知的耐受电离辐射最强的生物之一,能够高度耐受电离辐射、紫外线、H2O2、干燥以及其他DNA理化损伤剂的损伤。pprM基因是DR中功能未知的独特基因,生物信息学分析发现PprM拥有CSD结构域(“Cold-shock”DNA-binding domain),推测其可能是一种DNA结合蛋白,能够与靶DNA结合而发挥相应的生物学效应。本研究拟应用目前在体内研究蛋白质-DNA相互作用的最佳的方法染色质免疫沉淀技术(ChIP)来筛选PprM蛋白相互作用的靶DNA,探索PprM与它们的调控关系。方法:本研究通过设计并合成能够扩增HA-pprM基因全长的引物,以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模版,PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长,大小约438bp,经NdeⅠ酶切后,与pRADK载体连接后转化大肠杆菌,经培养、质粒提取纯化后,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序确认插入序列的正确性;将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM,以改良的CaC12法转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失菌株中,以表达HA-PprM融合蛋白,并用Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。然后使用HA-tag抗体顺利实施染色质免疫沉淀技术(ChIP)获得与PprM蛋白质具有相互作用的DNA混合液,分别设计4个关键基因的启动子区域的PCR引物,ChIP PCR的方法检测DNA混合液相应的启动子区域的结合情况。结果:成功构建pRADK-HA-pprM穿梭表达载体,经测序分析,序列无任何突变;成功转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失菌株中,并通过Western blot验证回补株中能够表达HA-PprM融合蛋白;染色质免疫沉淀(ChIP)与ChIP PCR实验结果显示成功筛选到3个与PprM蛋白具有相互作用的靶DNA,分别是pprI、pprA、recA的启动子。结论:1.成功构建了pRADK-HA-pprM穿梭表达载体,并获得耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株;2.应用ChIP PCR技术发现2 kGy辐照及未辐照条件下耐辐射奇球菌Ppr M蛋白均不与自身基因启动子结合;未辐照条件下PprM蛋白不与pprI、recA基因启动子结合而与pprA基因启动子结合;2 kGy辐照条件下PprM蛋白与pprI、recA、pprA三基因启动子均结合,且与pprA基因启动子结合能力增强。提示PprM蛋白可能作为一种辐射应激转录因子调控耐辐射奇球菌抗辐射调控网络重要元件pprI、recA、pprA基因的表达。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378

【引证文献】

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1 潘宝平;马云;何淑雅;;环境应激蛋白PprM研究进展[J];中南医学科学杂志;2017年01期

本文编号：2746591