钙信号介导的肠黏膜离子转运的调节机制

发布时间：2020-07-08 08:18

【摘要】：目的:1)国内外既往的研究,对于依托c AMP、c GMP等细胞内信使相关的肠黏膜离子转运的分子生物学机制已经相当清楚,但对于是否存在单独依赖于胞内钙信号的离子转运调控及其分子机制,知之甚少。本课题通过研究小肠上皮细胞,单独依赖于钙信号调控的氯离子及碳酸氢盐分泌及其机制,以开创胞内钙信号调控肠黏膜上皮细胞离子转运研究的新领域;2)众所周知,氯离子的分泌与肠道内水平衡及腹泻、便秘密切相关;而肠道碳酸氢盐的分泌在肠黏膜保护及机体酸碱平衡中起到重要的作用。通过针对钙信号介导的肠黏膜上皮细胞离子转运的调节机制研究,既能揭示新颖的肠道内水平衡调节和肠黏膜屏障的保护作用,又能为治疗溃疡、炎症性肠病(IBD)、腹泻、便秘等疾病的防治提供新的思路;方法:Ussing Chamber(多通道电流电压钳)是研究跨上皮细胞离子转运的重要技术,可用于包括离子转运、营养物质转运及药物转运等的研究。我们取小鼠十二指肠上皮,用Ussing Chamber仪器检测加入上皮顶端膜侧和基底膜侧改变胞内钙信号的不同工具药物后,由于氯离子和碳酸氢根离子分泌产生的短路电流(Isc)变化,反应十二指肠上皮细胞不同极性相关通道蛋白的生物学功能情况以及钙信号对肠黏膜离子转运的调节机制。结果:咖啡因激活小鼠十二指肠黏膜上皮细胞内质网上的RyR受体,通过钙信号导致短路电流的增加。而增加的短路电流强度可以被上皮细胞基底膜侧,而非顶侧端的无钙环境和选择性钙库操作性钙离子通道(store-operated calcium channel,SOC)抑制剂所明显抑制。我们进一步发现在十二指肠基底膜侧,CRAC/Orai通道在介导细胞外钙内流的过程中起着重要的作用。咖啡因激活RyR受体后导致的细胞内钙释放的增加,和介导上述通道导致细胞外钙内流后形成的钙信号,共同作用导致十二指肠上皮细胞顶端膜侧的Ca CCs(钙激活的氯离子通道)和AE(阴离子交换蛋白)激活,其产生的短路电流强度均可被Ca CCs和AE的抑制剂所抑制;另外,我们发现用c AMP通路的激动剂Forskolin和咖啡因共同添加可以增强短路电流,而两者前后分别添加产生的增强电流作用有所区别。先添加Forskolin可以增强咖啡因产生的短路电流,但先添加咖啡因却不能增强Forskolin产生的短路电流。结论:咖啡因作用于细胞内质网RyR受体使内钙释放及CRAC/Orai通道介导的钙库操作性钙离子内流,共同导致细胞质中的钙离子浓度增加,产生的钙信号在十二指肠上皮细胞离子分泌过程中发挥重要的调节作用。上述钙信号作用于细胞顶端膜侧的Ca CCs(钙激活的氯离子通道)和AE(阴离子交换蛋白),达到单独调节氯离子和碳酸氢根分泌的作用。而经典的c AMP通路可以与上述钙信号产生协同作用促进上皮细胞的离子分泌。我们的研究为保护上消化道黏膜及维持小肠的水电解质平衡提供了新的药物作用靶点。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R333
【图文】：

RyR受体抑制剂作用后的Isc变化

遵义医学院硕士学位论文 何佳A 图示 RyR 受体的阻断剂 Ruth red 加入后的 Isc 变化；B 图示 RyR 受体的阻断剂 Dan 分别加入顶端膜和基底膜侧（s）的 Isc 变化。进一步需要确定细胞内钙的释放是否可以调节细胞外钙内流进入上皮细胞；继续应用 Ussing Chamber 试验，比较在基底膜侧细胞外液是否有钙的情况下，因激动导致的短路电流的变化。如图 2 所示，当基底膜侧细胞外液无钙时，用咖激动导致的短路电流跟基底膜侧细胞外有钙的情况比较，电流有明显的减弱（P<0而当顶端膜侧无钙和顶端膜及基底膜侧同时无钙的情况下，电流的衰减并不明显

图 3 SOCE 抑制剂作用后的 Isc 变化。A 图示 SOCE 抑制剂 2-APB 分别加入顶端膜侧（m）和基底膜侧（s）的 Isc 变化；B 图示 SOCE 抑制剂别加入顶端膜侧（m）和基底膜侧（s）的 Isc 变化;C 图示 SOCE 抑制剂 FFA 分别加入顶端膜侧（m）和基底膜的 Isc 变化。综上所述，咖啡因结合 RyR 受体引起细胞内钙释放的增加，钙库耗竭后，在十二指肠上皮细胞的基底膜侧促进外钙内流的过程中发挥了重要的作用。2.3 CRAC/Orai 通道在咖啡因刺激肠道分泌中的调节作用。前面的实验过程中，我们筛选了 SOCE 在十二指肠上皮细胞分泌中的作用。们进一步筛选与 SOCE 相关的分子机制前，我们还筛选了是否有其他的介导外钙的通道参与了咖啡因与 RyR 受体结合后产生的钙信号的生理学效应，我们选择了的位于基底膜侧的促进外钙内流的通道，例如：TRPV1，TRPV4 和 NCX，分别选

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本文编号：2746319